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细胞冻存原理+操作步骤+注意事项

阅读次数:238   发布时间:2024/5/14 10:47:09

 

  冻存原理

当细胞所处温度低于0°C时,细胞脱水,细胞中可溶性物质浓度升高,并在细胞内形成冰晶,冰晶的大小对细胞的影响是不同的,大冰晶容易造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂,故造成复苏出来的细胞存活率、状态等与冻存的状态相差甚远。因此,我们在冻存细胞的时候会采取两个措施,一加入低温保护剂,二,慢冻细胞

冻存时机:细胞应在生长良好、密度约为 80-90%、数目一般为 10 6 -10 7 /ml,活力差的细胞在冻存后的成活率很小。

低温保护剂:常用的低温保护剂是二甲基亚砜DMSO,它是一种渗透保护剂,可迅速透入细胞,提高细胞膜对水的通透性,降低冰点,延缓冻结过程,能使细胞内水分在冻结透出细胞外,在胞外形成冰晶,减少胞内冰晶,从而减少冰晶对细胞的损伤。

慢冻细胞:可以使用程序性降温盒,缓慢冻存细胞,可使细胞内避免产生大的冰晶。如果没有程序降温盒,可以将冻存细胞依次放于4度1h,-20度2h,-80过夜,大部分细胞也可以适应。

冻存液配置:冻存液应该提配制,置于室温备用,防止临时配制产生的热量损伤细胞(DMSO加入到培养基中会放热),冻存液常规配比为培养基:血清:DMSO=7:2:1,如果细胞比较珍贵,可以调整为血清:DMSO=9:1。

  操作步骤:

1.用移液器吸走原培养基,加入适量PBS洗1-2遍;

2.消化细胞:加入适量胰酶,置于培养箱中37°C消化(10厘米大皿中加入1ml 0.25%的胰酶,消化4-5min,注意不同细胞消化时间不同,终止消化截点为镜下观察80%-90%以上的细胞变圆);

3.待消化到位后加入胰酶2倍体积的完全培养基终止消化,800-1000rpm离心3-5min;

4.准备好冻存管,标记上日期,细胞类别,人名,代数,待细胞离心后去上清,加入冻存液重悬,每管1-1.5ml,转移到冻存管中;

5.将冻存管放入程序降温盒中,-80度过夜,然后转移到液氮中保存。
  
  注意事项

1、  细胞加入冻存液之后立即放入-80度保存,勿常温放置太久

2、 冻存细胞储存在-80度中通常不建议超过半年,液氮中通常不建议超过2年。

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