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细胞裂解液的制备与裂解方法介绍

点击次数:107   发布时间:2024/5/10 9:57:52

 

细胞裂解液的制备

一、试剂准备
1、新鲜配制冷的RIPA裂解缓冲液:
150mMNaCL
1%NP-40(去垢剂)
0.1%SDS(去垢剂)
2ug/mlAprotinin(蛋白酶抑制剂)(使用加入)
2ug/mlLeupeptin(蛋白酶抑制剂)(使用加入)
1mMPMSF(蛋白酶抑制剂)
1.5mMEDTA(蛋白酶抑制剂)
1mMNaVanadate(磷酸脂酶抑制剂)(任选)
以上所有试剂均按比例溶于150mMNaCL溶液中。
2、冷的PBS中加入1mMPMSF
1.5mMEDTA
1mMNaVanadate(钒酸钠)(任选)
3、对数期生长状态佳的细胞,75cm至少3-4瓶(90%以上生长面积)。

二、实验步骤
1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上,用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面,以洗去瓶中残留的培养基,倒掉PBS,重复以上操作2-3遍。在/后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS,尽量在冰上操作。
2、向培养瓶中加入冷的RIPA裂解缓冲液(每75cm2培养瓶加1ml).然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞,如果所需要刮的同种细胞有多瓶,则将第1瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮(由于处理后的细胞裂解液较粘稠,所以宜用直径大点的吸液管吸取)。
3、吸出刮好的细胞裂解液置于14ml离心管中(置于冰上),然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。
4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中,样品插入冰盒进行超声,超声强度以不产生泡沫为准,超声每次2-3,重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀,应离心10000rpm,10分钟,留取上清。
5、取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度(用BioradBradford试剂盒或紫外分光光度计,在A280测定),分装保存在-70℃。

细胞裂解一般用物理或者化学方法

物理法:
(1)反复冻融:将细胞反复放置于-20℃冷冻以及25-30℃环境下,反复冷冻溶解10次-20次。适用于例如血细胞等大部分哺乳动物细胞。
(2)煮沸法:与冻融法相反,将细胞放置于100℃沸水煮沸5-10分钟,适用于大部分微生物细胞。
(3)超声法:将细胞放置于超声破碎仪中,以一定频率的超声破碎细胞,适用于绝大部分微生物细胞。
(4)渗透压法:将血细胞等细胞膜较为薄弱的细胞放置于纯水等低渗溶液,细胞吸收大量水分破解。
(5)液氮法:植物细胞一般采用液氮捻磨的方法破解细胞。

化学法:
(1)强酸、强碱溶液:一般应用0.5NNaOH溶液可以裂解绝大部分动物细胞和微生物细胞。
(2)生物酶:一般用溶菌酶、蛋白酶K等酶裂解微生物细胞。

原创作者:上海岑特生物科技有限公司

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