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使用多聚甲醛固定细胞爬片、甩片或切片的方法

阅读次数：184 发布时间：2024/11/14 9:38:22

当纯净甲醛在水溶液中溶解时，会自动聚合成长链的多聚甲醛。其长度不一，在水中同时进行聚合与解聚反应。甲醛易溶于脂类物质，因此能穿过细胞膜进入细胞内。用多聚甲醛固定细胞时，能使细胞内的自由氨基基团发生化学交联。当不同的分子发生交联时，形成一网状结构，把细胞的各个结构成分连接起来。

单独用多聚甲醛固定细胞不能使抗体进入细胞内，在检测细胞内抗原时，标本经多聚甲醛固定后必须用非离子去污剂透化标本。

不主张使用商业甲醛溶液作为细胞染色的固定液，因为商业甲醛实际上是甲醛和甲醇（乙醇）的混合物，甲醇和乙醇的作用是防止甲醛分子聚合，使其保持单体状态。使用商业甲醛处理细胞有两个缺陷：不具有多聚甲醛固定细胞的优点；细胞却被甲醇固定。

多聚甲醛固定方法为：

①用PBS洗涤玻片或培养皿；如果是单个的载玻片或盖玻片，用镊子镊取，放入装有PBS的烧杯中。如果载玻片或盖玻片的数量较多，将其放在用的支架上。如果是培养皿，将PBS倒入其中洗涤；

②倒掉PBS，但勿使标本干燥；

③加入4%多聚甲醛(临用配制)，室温下静置10min；

④用PBS洗涤细胞两次；

⑤用含0.2%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的细胞2min（室温），有些标本可能需要长达15min，时间视抗原而定；

⑥PBS洗涤细胞4次，洗涤时间不少于5min。此时，可加入抗体。

常见问题：

用交联剂如多聚甲醛固定蛋白质比用有机溶剂能更好地保持细胞结构，但可能降低某些细胞组分的抗原性。经多聚甲醛固定后，与胞内自由氨基结合的抗体也许不再识别这些抗原。如果抗体在其他实验中效果良好，但在经多聚甲醛固定的标本中不能有效地作用，可以尝试逐步降低多聚甲醛的浓度。这样虽然使细胞内各成分的交联程度降低，但有利于细胞结构的保持，可以使抗体更好地与抗原中的某些结合部位接触。

注意事项：

①多聚甲醛的固定是不稳定的，标本经多聚甲醛固定后应再经去污剂处理，如果标本在水溶液中浸泡的时间过长，则会使交联结构解体。因此，应避免固定后的标本在水溶液中浸泡的时间过长；

②若用多聚甲醛固定悬浮细胞，因为细胞呈悬浮状态，洗涤过程复杂，因此，应注意离心时间不要过长或转速太高。一般用200×g离心5min。

在免疫染色实验中，如果可用的抗体使用效果均不佳，有三种方法可以使之改善。

先建议试用上述两种固定方法，因为这两种方法的固定机制存在很大区别。抗体在一种固定方法中检测效果不理想，有可能在另一种固定方法中工作良好。第二个解决问题的方法是降低固定液的浓度，用系列稀释的固定液进行试验。下面选择的方法虽然简单，但在非常低浓度固定液的情况下，仍能达到良好的固定效果。第三种方法是根据固定方法来制备抗体，先将抗原用固定液固定后，再去免疫动物产生抗体。在这种情况下，所用抗原将和实验中固定后的抗原非常相似，能够获得结合固定抗原的抗体。