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质粒大量抽提操作过程及技巧详解
阅读次数：230 发布时间：2024/8/16 9:44:03
1. 取过夜菌至50毫升离心管内，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集100毫升过夜菌沉淀。
通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2-4。建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心1分钟，如沉淀不充分则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密，不利于加入溶液I后散开沉淀。直接倒掉上清，再倒入约50毫升菌液并重复上述操作，然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸)，使液体流尽。如果细菌密度明显偏低，可考虑使用更多菌液，再重复上述操作1-2次。对于高拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过150毫升，对于低拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过200毫升。过量的细菌会导致后续的裂解不充分。
2. 每管加入5毫升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。
确认溶液I中已添加了RNase A。高速度vortex 10-20或更长时间，悬起沉淀。一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液，无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex，可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开，或手指把沉淀弹开。
3. 每管加入5毫升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，室温放置1-2分钟，使细菌完全裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致终所得质粒被基因组DNA污染。颠倒4-6次后，溶液应变得透明，无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有完全散开，那么颠倒4-6次后，可能还会有团块或絮状物。遇到有少量团块或絮状物产生的情况，可以增加颠倒次数3-5次，再室温放置2-3分钟，但总裂解时间不可超过5分钟。
4. 每管加入7毫升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。
切勿vortex！颠倒次数也不宜过多，否则易导致终所得质粒的质量下降。
5. 12,000-14,000rpm)室温离心10分钟。
如果离心机的高速度较低，需要适当延长离心时间，例如约5000-6000rpm时需要离心20-30分钟或更长时间，直至沉淀充分。离心时可以准备好质粒纯化柱，自制漏斗等，并在纯化柱上标上记号。
6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。12,000-14,000rpm离心2分钟，倒弃收集管内液体。
质粒倒入质粒纯化柱后，可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。本步骤及后续需要12,000-14,000rpm离心2分钟的步骤，如果离心机的高速度较低，需要适当延长离心时间，例如约5000-6000rpm时需要离心约5分钟或更长时间，直至液体全部穿柱。如果离心后有少量漂浮物，可以考虑再次离心，或者使用擦镜纸两次对折后打开形成的自制漏斗，以过滤去除漂浮物。
7. 在质粒纯化柱内加入12毫升溶液IV，12,000-14,000rpm离心2分钟，洗去杂质，倒弃收集管内液体。
加入溶液IV后可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。
8. 12,000-14,000rpm再次离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。
注意：倒弃收集管内液体后再离心，才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。
9. 将质粒纯化柱置于50毫升离心管上，加入2毫升溶液V至管内柱面上，放置2分钟。
也可以用重蒸水或MilliQ纯水替代溶液V，但是水的pH应不小于6.5。溶液V加入后放置时间稍长，对于增加质粒产量会略有帮助。如想得到较高浓度的质粒，可以加入1毫升溶液V洗脱，质粒得率实测减少约5-10%，具体减少量与特定样品有关。
10. 12,000-14,000rpm离心2分钟，所得液体即为转细胞超纯质粒。
通常所得质粒浓度为0.1-0.3mg/ml左右，可以用于细胞转染。如果想得到高浓度的质粒，可以采用如下的异丙醇沉淀方法浓缩质粒或常规的乙醇沉淀方法。
a. 加入0.7倍体积的常温异丙醇(例如1毫升待浓缩质粒中加入0.7毫升异丙醇)，混匀后1,2000-14,000rpm 4℃离心10分钟，小心吸去上清液，避免触及沉淀。
如果希望获得较高浓度的质粒，在洗脱时推荐采用1毫升洗脱液进行洗脱，后续可以转移到2毫升离心管内进行异丙醇沉淀，这样操作起来相对比较方便。异丙醇沉淀的DNA为玻璃状近透明的颗粒状沉淀，和乙醇沉淀产生的含盐沉淀物相比较难观察清楚。离心后取放离心管要尽量轻柔，避免沉淀松动或部分颗粒状悬浮至溶液中。不推荐直接倒弃上清，直接倒弃上清时经常出现直接把质粒沉淀倒掉的情况；如果偏好直接倒弃上清，建议把上清倒弃至一洁净离心管内，这样万一沉淀被倒出，仍然可以从洁净离心管中回收。推荐用移液枪吸去上清，并注意尽量避免吸走沉淀。
b. 加入1毫升常温70%乙醇溶液，轻轻悬起质粒沉淀以充分洗涤，12,000-14,000rpm 4℃离心5-10分钟，小心吸去上清液，避免触及沉淀。
c. 5,000-10,000rpm 4℃离心5-10，用20微升或200微升移液器小心吸净残留液体，避免触及沉淀。
d. 肉眼观察无明显液体后(吸净液体后通常在1分钟内即可完成干燥)，加入适当体积的溶液(如溶液V、10mM Tris-Cl pH8.5或Milli-Q纯水)溶解DNA。
DNA样品不能过于干燥，否则很难溶解。好在弱碱性条件下溶解DNA，溶解时可用缓冲液反复冲洗管壁，使管壁上的DNA充分溶解。
附表1. EndA- ａnd EndA+ strains of E. coli.
EndA- EndA+
BJ5183 BL21(DE3)
DH1 CJ236
DH20 HB101
DH21 JM83
DH5α JM101
JM103 JM110
JM105 LE392
JM106 MC1061
JM107 NM522 (all NM series are EndA+)
JM108 NM554
JM109 P2392
MM294 PR700 (all PR series are EndA+)
SK1590 Q358
SK1592 RR1
SK2267 TB1
SRB TG1
0 Y1088 (all Y10 series are EndA+)
XL1-Blue BMH 71-18
XLO ES1301
通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2-4。建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心1分钟，如沉淀不充分则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密，不利于加入溶液I后散开沉淀。直接倒掉上清，再倒入约50毫升菌液并重复上述操作，然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸)，使液体流尽。如果细菌密度明显偏低，可考虑使用更多菌液，再重复上述操作1-2次。对于高拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过150毫升，对于低拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过200毫升。过量的细菌会导致后续的裂解不充分。
2. 每管加入5毫升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。
确认溶液I中已添加了RNase A。高速度vortex 10-20或更长时间，悬起沉淀。一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液，无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex，可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开，或手指把沉淀弹开。
3. 每管加入5毫升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，室温放置1-2分钟，使细菌完全裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致终所得质粒被基因组DNA污染。颠倒4-6次后，溶液应变得透明，无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有完全散开，那么颠倒4-6次后，可能还会有团块或絮状物。遇到有少量团块或絮状物产生的情况，可以增加颠倒次数3-5次，再室温放置2-3分钟，但总裂解时间不可超过5分钟。
4. 每管加入7毫升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。
切勿vortex！颠倒次数也不宜过多，否则易导致终所得质粒的质量下降。
5. 12,000-14,000rpm)室温离心10分钟。
如果离心机的高速度较低，需要适当延长离心时间，例如约5000-6000rpm时需要离心20-30分钟或更长时间，直至沉淀充分。离心时可以准备好质粒纯化柱，自制漏斗等，并在纯化柱上标上记号。
6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。12,000-14,000rpm离心2分钟，倒弃收集管内液体。
质粒倒入质粒纯化柱后，可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。本步骤及后续需要12,000-14,000rpm离心2分钟的步骤，如果离心机的高速度较低，需要适当延长离心时间，例如约5000-6000rpm时需要离心约5分钟或更长时间，直至液体全部穿柱。如果离心后有少量漂浮物，可以考虑再次离心，或者使用擦镜纸两次对折后打开形成的自制漏斗，以过滤去除漂浮物。
7. 在质粒纯化柱内加入12毫升溶液IV，12,000-14,000rpm离心2分钟，洗去杂质，倒弃收集管内液体。
加入溶液IV后可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。
8. 12,000-14,000rpm再次离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。
注意：倒弃收集管内液体后再离心，才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。
9. 将质粒纯化柱置于50毫升离心管上，加入2毫升溶液V至管内柱面上，放置2分钟。
也可以用重蒸水或MilliQ纯水替代溶液V，但是水的pH应不小于6.5。溶液V加入后放置时间稍长，对于增加质粒产量会略有帮助。如想得到较高浓度的质粒，可以加入1毫升溶液V洗脱，质粒得率实测减少约5-10%，具体减少量与特定样品有关。
10. 12,000-14,000rpm离心2分钟，所得液体即为转细胞超纯质粒。
通常所得质粒浓度为0.1-0.3mg/ml左右，可以用于细胞转染。如果想得到高浓度的质粒，可以采用如下的异丙醇沉淀方法浓缩质粒或常规的乙醇沉淀方法。
a. 加入0.7倍体积的常温异丙醇(例如1毫升待浓缩质粒中加入0.7毫升异丙醇)，混匀后1,2000-14,000rpm 4℃离心10分钟，小心吸去上清液，避免触及沉淀。
如果希望获得较高浓度的质粒，在洗脱时推荐采用1毫升洗脱液进行洗脱，后续可以转移到2毫升离心管内进行异丙醇沉淀，这样操作起来相对比较方便。异丙醇沉淀的DNA为玻璃状近透明的颗粒状沉淀，和乙醇沉淀产生的含盐沉淀物相比较难观察清楚。离心后取放离心管要尽量轻柔，避免沉淀松动或部分颗粒状悬浮至溶液中。不推荐直接倒弃上清，直接倒弃上清时经常出现直接把质粒沉淀倒掉的情况；如果偏好直接倒弃上清，建议把上清倒弃至一洁净离心管内，这样万一沉淀被倒出，仍然可以从洁净离心管中回收。推荐用移液枪吸去上清，并注意尽量避免吸走沉淀。
b. 加入1毫升常温70%乙醇溶液，轻轻悬起质粒沉淀以充分洗涤，12,000-14,000rpm 4℃离心5-10分钟，小心吸去上清液，避免触及沉淀。
c. 5,000-10,000rpm 4℃离心5-10，用20微升或200微升移液器小心吸净残留液体，避免触及沉淀。
d. 肉眼观察无明显液体后(吸净液体后通常在1分钟内即可完成干燥)，加入适当体积的溶液(如溶液V、10mM Tris-Cl pH8.5或Milli-Q纯水)溶解DNA。
DNA样品不能过于干燥，否则很难溶解。好在弱碱性条件下溶解DNA，溶解时可用缓冲液反复冲洗管壁，使管壁上的DNA充分溶解。
附表1. EndA- ａnd EndA+ strains of E. coli.
EndA- EndA+
BJ5183 BL21(DE3)
DH1 CJ236
DH20 HB101
DH21 JM83
DH5α JM101
JM103 JM110
JM105 LE392
JM106 MC1061
JM107 NM522 (all NM series are EndA+)
JM108 NM554
JM109 P2392
MM294 PR700 (all PR series are EndA+)
SK1590 Q358
SK1592 RR1
SK2267 TB1
SRB TG1
0 Y1088 (all Y10 series are EndA+)
XL1-Blue BMH 71-18
XLO ES1301
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