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【蛋白纯化率】选对蛋白酶抑制剂的重要性

阅读次数：221 发布时间：2024/8/12 9:48:37

当细胞破碎的时候，蛋白水解酶就会被释放出来或被激活，使电泳结果复杂化，影响zui终结果分析。为了避免这些情况的出现，建议在样品制备时尽可能在低温下进行。此外，许多蛋白酶在PH9以上就失活了，因此Tris碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持着活性，此时应当使用蛋白酶抑制剂。因此对于我们想要研究的蛋白来说，选择性和有效的抑制这些蛋白酶对于蛋白纯化路线设计来说显得尤为重要。

蛋白酶抑制剂与蛋白酶一样，都是纷繁复杂的，通常使用许多化学物质作为蛋白酶抑制剂，如 PMSF 和 leupeptin 。而且由于一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用，因此通常建议复合使用蛋白酶抑制剂，如广谱蛋白酶抑制剂“鸡尾酒”，见下表（来自《蛋白质电泳实验技术》）。

蛋白酶抑制剂	有效抑制的酶
PMSF ( Pheylmethylsulfonyl fluoride )是很常见的抑制剂，使用浓度为 1mmol/L	不可逆抑制丝氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。
AEBSF 丝氨酸抑制剂，使用浓度为 4mmol/L	AEBSF 的抑制活性与 PMSF 相近，但它更易溶于水而且毒性低
EDTA，EGTA，使用浓度为 1mmol/L	通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶。
多肽蛋白酶抑制剂，使用浓度为 2-20ug/ml	亮肽素（Leupeptin）能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶；抑肽素（pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶；抑肽酶（aprotinin）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制剂（bestatin）能抑制氨基酸多肽酶
TLCk，TPCK，使用浓度为 0.1-0.5mmol/L	不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶
苄脒（Benzamidine）使用浓度为 1-3mmol/L	抑制丝氨酸蛋白酶

蛋白酶的功能和分类

蛋白酶功能 :
涉及到许多细胞内和细胞外的过程:
1.食物蛋白在消化道的消化
2.激活无活性酶原和多肽激素/神经转移介质的释放
3.调节血凝物质和纤维素
4.内源性和外源性蛋白的细胞内消化
5.跨膜的蛋白转移
6.微生物对生物体攻击,通过释放蛋白酶导致毒性的增加

蛋白酶分类 :
根据催化中心结构的不同蛋白酶可分为4类:
1.丝氨酸蛋白酶在其活性中心含有丝氨酸和组氨酸，如:糜蛋白酶, 弹性蛋白酶，血纤维蛋白溶酶，凝血酶，枯草杆菌蛋白酶，胰酶 Chymotrypsin, Elastase, Plasmin, Subtilisin, Thrombin, Trypsin
2.半胱氨酸蛋白酶（别名:硫醇或 SH 蛋白酶）在其催化中心含有半胱氨酸，如: Calpain, 组织蛋白酶 B,C 和 L，和木瓜蛋白酶
3.天(门)冬氨酸蛋白酶（羧基蛋白酶）在其活化中心含有天(门)冬氨酸，如: 组织蛋白酶 D, 木瓜蛋白酶, 肾素
4.金属蛋白酶含有金属离子，即: 锌2+在其催化中心，如氨基肽酶，羧基蛋白酶 A 和 B 嗜热菌蛋白酶

在分离蛋白时，组织或细胞裂解液中充满了来自溶酶体的酶,并且原来无活性的蛋白酶原被充分激活,开始消化其周围的蛋白质。为避免此因素，蛋白酶抑制剂必须被加入在缓冲液内以阻止蛋白酶对细胞组织的消化作用。来自哺乳类动物，植物，霉菌或细菌的组织，蛋白酶成分是不同的,并根据机体状态的发展蛋白酶也可以发生变化。哺乳类动物组织分离时比细菌或其它组织分离时更需要应用蛋白酶抑制剂使组织细胞受到完全的保护。