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RNA 和 DNA 提取实验中的问题解决

阅读次数：261 发布时间：2024/6/20 10:08:39

　　RNA和DNA提取：

　　裂解：裂解公式可能因您要提取 DNA 还是 RNA 而异，但共同点是含有高浓度离液盐的裂解缓冲液。

　　Chaotropes（离液剂）的作用：Chaotrope会破坏氢键及疏水间的相互作用。离液盐包括盐酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。

　　洗涤剂：除了离液剂外，裂解缓冲液中通常还有一些去污剂，以帮助蛋白质溶解和裂解。

　　溶菌酶和蛋白酶K:根据样品类型，也可以使用酶进行裂解。蛋白酶 K 就是其中，实际上在这些变性缓冲液中效果较好；当蛋白质变性增多，蛋白酶 K 的作用也会相应增强。然而，溶菌酶在变性中不起作用，因此溶菌酶处理通常在添加变性盐之进行。

　　RNA和DNA提取实验中的问题

　　1.产量低

　　如果您遇到的 DNA/RNA 产量低于您对样品的预期，则需要考虑许多因素。通常，这是一个裂解问题。不完全裂解是产量低的主要原因。它也可能是由不正确的绑定条件引起的。确保使用新鲜的优质乙醇（100% 200 标准）稀释缓冲液或添加到结合的步骤。劣质乙醇或旧库存可能已经吸收了水分，并且浓度不正确。如果洗涤缓冲液制备不正确，您可能正在洗掉提取的 DNA 或 RNA。

　　2.低纯度

　　如果提取的 DNA 被蛋白质污染（低 260/280），那么您可能开始时样品过多，而蛋白质没有完全去除或溶解。

　　如果 DNA 的 260/230 比率不佳，则问题通常是结合或洗涤缓冲液中的盐分。确保使用高质量的乙醇来制备洗涤缓冲液，如果问题仍然存在，请再次洗涤色谱柱。

　　与其他样品相比，一些样品含有更多的抑制剂。环境样品特别容易出现纯度问题，因为腐殖质在提取过程中会被溶解。

　　腐殖质的行为与 DNA 相似，很难从硅胶柱中去除。

　　3.降解

　　降解问题是RNA制备中常常到的问题。因为在 RNA 提取过程中，样品储存不当或裂解效率低等情况都会导致降解。对于 DNA 提取，降解不是一个大问题，因为对于 PCR，DNA 可以被剪切并且工作正常，如果不希望有较多剪切的 DNA，可以使用弱裂解的方法。

　　PCR 清理时的注意事项

　　PCR 净化其实并不是 DNA 提取技术本身，但它是一种效率高且简单的技术，它只是添加高浓度的结合盐（通常每体积 PCR 反应 3-5 体积盐）和离心来过滤。

　　在实验过程中，PCR Clean-up 试剂盒出现故障也会导致整个实验功亏一篑。

　　因为在PCR 反应中有较多吸收 260 度紫外线的物质，比如：核苷酸、去污剂、盐和引物。所以，PCR 净化试剂盒经常无法正常工作可能是由于 PCR 反应失败所造一般成较难清理。