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琼脂糖凝胶电泳实验原理与注意事项
阅读次数:264 发布时间:2024/6/14 9:51:53
琼脂糖凝胶电泳检测DNA原理
琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片段的典型方法,其特点为简便、快速。
DNA片段琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同,DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动,除电荷效应外,凝胶介质还有分子筛效应,与分子大小及构想有关。
对于线形DNA分子,其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。核酸分子是两性解离分子,pH3.5是碱基上的氨基解离,而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离,所以分子带正电,在电场中向负泳动;而pH8.0-8.3时,碱基几乎不解离,而磷酸基团解离,所以核酸分子带负电,在电场中向正泳动。
琼脂糖凝胶电泳的适用范围
琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖,具亲水性,但不带电荷,是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下(pH8.0的缓冲液)带负电荷,在电场中通过凝胶介质向正移动,不同DNA分子片段由于分子和构型不同,在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭(EB)可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物,经紫外线照射后,可分出不同的区带,达到分离、鉴定分子量,筛选重组子的目的。
(按0.3-1.5%的琼脂糖含量,1-25kb大小的DNA用1%的凝胶,20-100kb的DNA用0.5%的凝胶,200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶)
琼脂糖凝胶电泳实验需注意以下几点:
1.体系配制时候关键的几个试剂一定要确定它们还有效、或者还没被污染:引物,酶,超纯水。这些东西好自己收好,写上个人的名字放好,冰盒上记得带上橡皮筋,这样就不会因为别人翻冰箱时候把你的冰盒碰散了,试剂都碰掉。否则,你的试剂被污染了,到时候阴性对照狂出条带,再去找污染源很麻烦。而且配置体系时候要注意保持实验区的干净,事先可用小喷壶进行酒精喷雾,固定空气中的DNA,而且全程要戴手套,避免污染体系。
2.pcr体系要摸准,好用人家都做得很多的老体系来上手。
3.要想得到漂亮的电泳图,可以在PCR开始时候就把胶倒上(提是你的PCR总时间在1.5小时左右,并且1.5小时候之后你还在实验室。),让凝胶凉着,这样凝胶的上样孔会比较规则,胶体里面的其本身的孔径也会较规则。如果你要第二天再跑胶,千万记得把PCR完毕的样本放入4℃保存。第二天做时候建议把胶凉上25分钟左右。
4.琼脂糖凝胶电泳上样时候建议使用排枪上样,不仅快速而且样本加到胶孔里的速度一致。当然,排枪上样好选用进口枪头。
5.不管电泳室使用的频率高还是低,我都建议每次琼脂糖凝胶电泳时候更换电泳液,避免出现“^”形条带。
琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片段的典型方法,其特点为简便、快速。
DNA片段琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同,DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动,除电荷效应外,凝胶介质还有分子筛效应,与分子大小及构想有关。
对于线形DNA分子,其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。核酸分子是两性解离分子,pH3.5是碱基上的氨基解离,而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离,所以分子带正电,在电场中向负泳动;而pH8.0-8.3时,碱基几乎不解离,而磷酸基团解离,所以核酸分子带负电,在电场中向正泳动。
琼脂糖凝胶电泳的适用范围
琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖,具亲水性,但不带电荷,是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下(pH8.0的缓冲液)带负电荷,在电场中通过凝胶介质向正移动,不同DNA分子片段由于分子和构型不同,在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭(EB)可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物,经紫外线照射后,可分出不同的区带,达到分离、鉴定分子量,筛选重组子的目的。
(按0.3-1.5%的琼脂糖含量,1-25kb大小的DNA用1%的凝胶,20-100kb的DNA用0.5%的凝胶,200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶)
琼脂糖凝胶电泳实验需注意以下几点:
1.体系配制时候关键的几个试剂一定要确定它们还有效、或者还没被污染:引物,酶,超纯水。这些东西好自己收好,写上个人的名字放好,冰盒上记得带上橡皮筋,这样就不会因为别人翻冰箱时候把你的冰盒碰散了,试剂都碰掉。否则,你的试剂被污染了,到时候阴性对照狂出条带,再去找污染源很麻烦。而且配置体系时候要注意保持实验区的干净,事先可用小喷壶进行酒精喷雾,固定空气中的DNA,而且全程要戴手套,避免污染体系。
2.pcr体系要摸准,好用人家都做得很多的老体系来上手。
3.要想得到漂亮的电泳图,可以在PCR开始时候就把胶倒上(提是你的PCR总时间在1.5小时左右,并且1.5小时候之后你还在实验室。),让凝胶凉着,这样凝胶的上样孔会比较规则,胶体里面的其本身的孔径也会较规则。如果你要第二天再跑胶,千万记得把PCR完毕的样本放入4℃保存。第二天做时候建议把胶凉上25分钟左右。
4.琼脂糖凝胶电泳上样时候建议使用排枪上样,不仅快速而且样本加到胶孔里的速度一致。当然,排枪上样好选用进口枪头。
5.不管电泳室使用的频率高还是低,我都建议每次琼脂糖凝胶电泳时候更换电泳液,避免出现“^”形条带。
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