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上海岑特分享：酶标记抗体的方法步骤
阅读次数：266 发布时间：2023/11/28 10:44:59
1、HRP标记抗体的方法
酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊2醛二步法和过碘d酸钠法。尤以简易过碘d酸钠法更为常用。
戊2醛二步法
原理
戊2醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊2醛-免疫球蛋白结合物。
2、标记步骤
(1)称取HRP25mg溶于1.25%戊2醛溶液中，于室温静置过夜。
(2)反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。
(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。
(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊2醛二步法和过碘d酸钠法。尤以简易过碘d酸钠法更为常用。
戊2醛二步法
原理
戊2醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊2醛-免疫球蛋白结合物。
2、标记步骤
(1)称取HRP25mg溶于1.25%戊2醛溶液中，于室温静置过夜。
(2)反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。
(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。
(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
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