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乙醇固定样品DNA抽提和直接PCR实验
阅读次数：351 发布时间：2023/5/4 11:34:41
实验概要
本实验从乙醇浸泡的鱼苗中提取DNA，并利用直接PCR进行了鉴定。
实验原理
在实际的研究工作中，野外取样的地点一旦较为偏远，受条件的限制，很难保证得到的样品活体或能够快速冷冻；另外，对一些稀有物种和濒危种，鲜活样品的采集十分困难，一般为了解决这些问题，常采用乙醇和甲醛固定的方法来处理样品，再对样品DNA 进行提取以及扩增。使用乙醇固定样品具有硬化，固定，脱水作用，对组织渗透迅速，特别适合组织中核酸的保存，相比于甲醛等其它固定方法，此法更简单，保存时间更长质量更好，也更加清洁无害。乙醇固定样品主要应用于水产种质资源鉴定，医院或兽医病理样品保存，法医样品保存等方面，在特定物种基因保护，生物多样性，动物分子标记，司法鉴定等方面有广泛的应用。
Omega Bio-Tek 相应试剂盒既能够快速有效的抽提得到乙醇保存多年的样品基因组DNA，又可以利用直接PCR 系统，快速的对乙醇保存样品进行PCR 鉴定，为您的研究提供有力的工具。
实验材料
乙醇浸泡的鱼苗
实验步骤
1. E.Z.N.A. Tissue Direct PCR kit
1) 分别取45ul AT1 和5ul AT2 到0.2ml PCR 管中，混合均匀。对于有较多样品需要操作的，可以先将AT1 和AT2 用量计算好，混合均匀后再分装到每一管中。
2) 取鱼苗一条，在AT4 中浸泡约5-10min，滤纸吸干水份。
3) 将鱼苗浸没在上一步准备的AT1 中56℃水浴或者PCR 仪上消化10-20min，中间可以涡旋混匀一次。
4) 消化完后的PCR 管置于90℃水浴或者PCR 仪上5min，稍微冷却后加入50ul AT3 涡旋混匀。
5) 以上裂解液就可以作为PCR 的模板直接使用，PCR 体系中建议加入5ul 左右。
6) 取5ul E.Z.N.A. Tissue Direct PCR kit 抽提得到的一条鱼苗的DNA 作为模板，客户提供的引物Y-30-R/F 作为引物，PCR 扩增。
7) PCR 扩增程序：
94℃ 2min；
94℃ 30S 52℃ 30S 72℃ 40S 33cycles；
72℃ 5min；
25℃ forever。
2. E.Z.N.A.? MicroElute? Genomic DNA Kit
1) 称量10mg 组织，加入200ul Buffer TL；
2) 加20ul OB，55℃孵化至完全降解；
3) 13,000xg 离心2min，转移上清至新管；
4) 加220ul Buffer BL 涡旋混匀，70℃孵化10min；
5) 加220ul 无水乙醇，大速度涡旋15s；
6) 将混合液过柱吸附，13,000xg 离心30-60s，弃滤液；
7) 加500ul Buffer HB，离心；
8) 700ul DNAWash Buffer（加乙醇）；
9) 13,000xg 离心2min，干燥柱子；
10) 加25ul 70℃预热的Elution Buffer 洗脱。
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