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【酶学基础】生物实验中酶的提取和分离纯化

阅读次数：341 发布时间：2023/4/20 10:53:31

　　许多酶都存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，先需要对细胞进行破碎处理。细胞破碎的方法很多，主要包括机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法等。机械破碎法是指利用捣碎机、研磨器或匀浆器等将细胞破碎开来。物理破碎法是指利用温度差、压力差或超声波等将细胞破碎开来。化学破碎法是指利用甲醛、丙酮等有机溶剂或表面活性剂作用于细胞膜，使细胞膜的结构遭到破坏或透性发生改变。酶学破碎法是指选用合适的酶，使细胞壁遭到破坏，进而在低渗溶液中将原生质体破碎开来。

　　酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理细胞破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过程。酶的提取方法有盐溶液提取法、碱溶液提取法和有机溶剂提取法等。为了提高酶的提取率和防止酶提取后变性失活，提取过程中必须注意保持适宜的温度和pH，并且添加适量的保护剂。

　　提取液中含有多种酶，要想从提取液中分离纯化出某一种酶，必须根据这种酶的特性，选择适合的分离纯化方法。酶分离纯化的方法很多，下面简介利用酶相对分子质量的大小进行分离纯化的过程。

　　先，通过透析的方法，使提取液中的酶和其他蛋白质分子与提取液中的各种小分子物质分离开来。其次，通过高速离心使酶和其他蛋白质分子沉降。在高速离心的情况下，酶和其他蛋白质分子虽然都会发生沉降，但是沉降的速度因各自相对分子质量的不同而不同。人们利用这一原理就可以达到分离纯化酶的目的。具体做法是，取一只离心试管，管内注入具有连续浓度梯度的蔗糖溶液（试管上部溶液的浓度低，下部溶液的浓度高）。在蔗糖溶液的表层，小心地滴上含有酶和其他蛋白质的待分离纯化的液体。

　　通过高速离心后，酶和其他蛋白质就会沿着浓度梯度形成各自的区带，每个区带中只含有一种酶或一种蛋白质。将离心试管的底部钻一个小孔，使管内的溶液分段流出。这样就可以将各区带的溶液分开，进而通过结晶和干燥等方法获得所需要的那种酶。也可以将整个离心试管进行冷冻，然后通过切割获得含有所需酶的那个区带，进而通过结晶和干燥等方法获得那种酶。