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实验人如何正确制备细胞周期实验样品
阅读次数：406 发布时间：2023/3/29 10:26:21
细胞周期分析是分子生物学常用的实验方法，尤其在抗肿瘤药物研究上使用普遍。但细节若是处理不好，做得再多也做不出正确的、好看的分布图。天岑特生物来测下如何准确制备细胞周期测试的样品，科研实验的小伙伴们一起来了解下！
先简单介绍下实验原理
碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，可以与 DNA 和 RNA 结合，但其不能透过正常的细胞膜，所以对活细胞无染色作用。可通过冷乙醇或其他破膜剂的作用，使细胞膜通透性增加。PI 进入细胞内后，选择性地与核酸结合，RNase 裂解 RNA 后，细胞内染料的荧光量与细胞核内的 DNA 含量成正比。通过流式细胞仪检测单个细胞荧光强度得到相对 DNA 含量，根据各个时相 DNA 含量不同，将细胞分为不同的周期。
具体操作流程及注意事项
1、将对数期的细胞接种于 6 孔板中（2×105 个 / 孔，根据细胞大小、增值速度适当调整），每孔加 2 ml 培养基培养。
2、细胞贴壁后（根据细胞具体情况），去除培养基，分别加入培养基配置的不同浓度药物 1 ml 孵育（不使用造成细胞大量死亡的药物浓度和孵育时间）。
3、药物作用结束后，收集培养液，1500 rpm，离心 4 min。一定要一并收集漂浮的死细胞，不然会严重影响结果。
4、消化收取贴壁细胞，吹打过程一应要轻柔充分，避免细胞受损、细胞黏连；离心转速为 2000 rpm，离心 4 min（离心转速不要超过 2000 rpm，也可以采用 1000 rpm，离心 5 min），PBS 洗 3 遍，以去除培养基、药物残留及细胞碎片。合并培养液和贴壁细胞。
5、细胞沉淀中加入少量 PBS，轻柔充分重悬细胞。然后将重悬的细胞加入到 4℃预冷的 70％冰乙醇中固定，轻轻吹打均匀（切记！！！不要将冰乙醇加入到细胞中，这样会造成细胞黏连，严重影响结果），封口膜封口，4℃过夜。
6、2000 rpm 离心 4 min，吸去固定液，PBS 洗两次，以去除固定液。
7、细胞中加入含 PI（50 μg/ml）、RNaseA（50 μg/ml，去除 RNA）和曲拉通（1％，通透细胞膜）的工作液 200 μl（曲拉通粘性大，配置时一定要涡旋，保证混合均匀），室温避光孵育 30 min。按照步骤 1 中的铺板细胞数，这个体积的工作液可以保证测试时的细胞浓度正合适。
8、流式细胞仪检测细胞周期。染色后，可以使用 PBS 去除染液，也可选择不处理，亲测没有影响。
9、FlowJo 软件分析细胞周期时相分布。
实验人注意！注意！！注意！！！
整个过程一定要尽量降低操作对细胞的损伤，要吹打轻柔，减少离心次数，转速不要超过 2000 rpm。
消化细胞时要保证细胞吹散，不要有细胞黏连，一旦这一步骤没有消化充分，后面很难再将细胞吹散，后果严重。
测试时细胞浓度一定要根据流式细胞仪的检测范围，不然可能会影响准确度。
先简单介绍下实验原理
碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，可以与 DNA 和 RNA 结合，但其不能透过正常的细胞膜，所以对活细胞无染色作用。可通过冷乙醇或其他破膜剂的作用，使细胞膜通透性增加。PI 进入细胞内后，选择性地与核酸结合，RNase 裂解 RNA 后，细胞内染料的荧光量与细胞核内的 DNA 含量成正比。通过流式细胞仪检测单个细胞荧光强度得到相对 DNA 含量，根据各个时相 DNA 含量不同，将细胞分为不同的周期。
具体操作流程及注意事项
1、将对数期的细胞接种于 6 孔板中（2×105 个 / 孔，根据细胞大小、增值速度适当调整），每孔加 2 ml 培养基培养。
2、细胞贴壁后（根据细胞具体情况），去除培养基，分别加入培养基配置的不同浓度药物 1 ml 孵育（不使用造成细胞大量死亡的药物浓度和孵育时间）。
3、药物作用结束后，收集培养液，1500 rpm，离心 4 min。一定要一并收集漂浮的死细胞，不然会严重影响结果。
4、消化收取贴壁细胞，吹打过程一应要轻柔充分，避免细胞受损、细胞黏连；离心转速为 2000 rpm，离心 4 min（离心转速不要超过 2000 rpm，也可以采用 1000 rpm，离心 5 min），PBS 洗 3 遍，以去除培养基、药物残留及细胞碎片。合并培养液和贴壁细胞。
5、细胞沉淀中加入少量 PBS，轻柔充分重悬细胞。然后将重悬的细胞加入到 4℃预冷的 70％冰乙醇中固定，轻轻吹打均匀（切记！！！不要将冰乙醇加入到细胞中，这样会造成细胞黏连，严重影响结果），封口膜封口，4℃过夜。
6、2000 rpm 离心 4 min，吸去固定液，PBS 洗两次，以去除固定液。
7、细胞中加入含 PI（50 μg/ml）、RNaseA（50 μg/ml，去除 RNA）和曲拉通（1％，通透细胞膜）的工作液 200 μl（曲拉通粘性大，配置时一定要涡旋，保证混合均匀），室温避光孵育 30 min。按照步骤 1 中的铺板细胞数，这个体积的工作液可以保证测试时的细胞浓度正合适。
8、流式细胞仪检测细胞周期。染色后，可以使用 PBS 去除染液，也可选择不处理，亲测没有影响。
9、FlowJo 软件分析细胞周期时相分布。
实验人注意！注意！！注意！！！
整个过程一定要尽量降低操作对细胞的损伤，要吹打轻柔，减少离心次数，转速不要超过 2000 rpm。
消化细胞时要保证细胞吹散，不要有细胞黏连，一旦这一步骤没有消化充分，后面很难再将细胞吹散，后果严重。
测试时细胞浓度一定要根据流式细胞仪的检测范围，不然可能会影响准确度。
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