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关于封闭液不得不说的这些事儿
阅读次数：433 发布时间：2023/2/22 11:02:06
早的有关封闭的概念来源于免疫组化，1941年Albert Coons发表文章，采用一种封闭液可以消除抗体的非特异性结合。
原来，在免疫组化染色的过程中，发现有一些内源性的生物素，酶等非特异性物质干扰信号和增加背景，必须进行阻断才能达到好的效果，这里有几个英文词来形容它的功能（blocking或quench）。
所谓的好的视觉效果就是指高的信噪比（S/N），也就是降低背景信号。常用的封闭液一般有正常血清，脱脂奶粉，BSA，明胶等。
进入分子生物学时代，出现了好几个BLOT实验，如western blot，northern blot 和southern blot，还有一个dot blot。在这些实验中，无一例外地要使用到封闭液。
1984年，David. A Johnson给它命名为Blotto，起先我还认为这个词是根据blot起的商品名，后来查了一下原文，才知道是一个很有意义的缩写，叫做 (Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer)
这是一种不含有表面活性剂的封闭液，在western blot实验中防止非特异性结合的效果比BSA和明胶要好，可以显著降低检测的背景。后来，许多公司都开发了自己的独特封闭液的配方，并且商业化。目市场上有很多商业化的封闭剂产品。
封闭剂的主要功能可以归类为，
增强信噪比，
降低非特异性结合，
减少背景干扰，
稳定蛋白增加灵敏度。
同时，还必须具备以下特征：
有效地阻断检测物质与载体表面的非特异性结合；
不会阻碍试剂的包被；
具有稳定固相结合的功能（防止变性）；
没有酶的活性导致检测信号的改变或者反应物的降解；
每一批次的高度稳定。
从封闭剂的种类上来讲，可以将封闭剂分为以下几种：
1) 脱脂奶粉
先是便宜易得，一般2.5-5% 浓度可用.但是，牛奶中含有一些磷酸化蛋白，因此，对于抗磷酸化的抗体不建议使用。
脱脂牛奶在western blot中是一种为常见的封闭剂，效果相当的好。以每次到北美回来时，总不免带几公斤奶粉回来。和婴儿无关，只是封闭！
2)小牛血清白蛋白
和脱脂牛奶一样，小牛血清白蛋白也是一种很常见的封闭剂。BSA 一般配成浓度2-5%使用. 但是价格比较贵。
3) 明胶
明胶是胶原蛋白的水解产物，就是一种短链的胶原蛋白，冷水鱼皮中提取的的明胶在低温下可以很好地保持液态，稀释到 0.1-5%用于封闭。
与BSA或脱脂奶粉不同的是，明胶不含有血清成分，因此不会与哺乳动物的抗体发生交叉反应产生背景信号。
但是，明胶不太适合用于生物素放大系统的检测，因为明胶含有内源性的生物素，对检测信号会产生干扰。
4) 正常血清 (如：胎牛，家兔，山羊血清等。)
所谓的正常，就是动物无疾病，没有经过免疫如疫苗等，全血清中含有大量蛋白，可以用于封闭，但是一般情况下我们用的很少，
因为，它的封闭效果与BSA和脱脂奶粉相比，没有什么优势，而且血清也很贵，需要封闭的浓度也很高(~5-10%)。正常血清中含有大量的免疫球蛋白，会和哺乳类动物的抗体发生交叉反应。
5) 纯化的酪蛋白
酪蛋白是从牛奶中提取的蛋白质，是一种很老的封闭剂。的casein block现在还在广泛使用。必须知道casein就是一种磷酸化蛋白，因此不能用于磷酸化的检测。
单纯的酪蛋白不太好溶解，一般都是以钠盐的形式使用。溶解后的溶液呈半透明状态，好多人以为是污染后的浑浊，其实这只是一种错觉而已。
6) 非蛋白类封闭剂
Polyvinylpyrrolidone (PVP)是一种非蛋白类的水溶性聚合物，也是一种常用的封闭剂。可以结合NC膜或PVDF膜，与其它封闭剂联合使用，起到封闭作用。
尤其对于小分子的检测，大分子量的封闭剂的空间位阻，会影响小分子的结合。像PVP这样的封闭剂有很多，比如PVA，S7，S9等表面活性剂。
尤其是在侧向层析产品中，应用相当广泛。非蛋白类的封闭剂还包括糖类，蔗糖以及PEG也是一种很好的封闭剂，除了具有良好的封闭效果，还会起到稳定蛋白的作用。
7）吐温系列
谈了这么长时间的封闭液，居然没有提到吐温。有点不应该。虽然它也属于非蛋白类封闭剂，属于聚合物，属于表活，但是，作为封闭剂，必须单独拿出来讲。
吐温在封闭剂当中，我觉得称得起茶中大红袍，酒中的拉菲。我们常用的PBST和TBST，后面那个大写的T就是吐温：Tween。
它真实的名字叫做Polysorbate Sorbitan ，中文叫做聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，根据结构不同分为Tween-20，60，40，80等。
吐温的作用很强大，可以加在裂解液里溶解膜蛋白，可以加在结合液里用于稳定蛋白，可以和BSA混合作为封闭液，关键的吐温本身没什么毒性，还可以作为食品添加剂。
每个学免疫的人，对于封闭的理解，基本上都是从Tween-20和BSA开始启蒙的。
8) 商业化封闭液
一般情况下这些封闭液都含有一些神秘的蛋白和配方，再起一个响亮的名字：如SuperBlock。
可以推测其中不含磷酸化蛋白，不含有免疫球蛋白，不含白蛋白和生物素。还有一个特点就是封闭速度很快，让你可以缩短实验的时间。缺点就是很贵，一分钱一分货。
既然话题是封闭液，不能单说封闭剂，还得谈谈溶液的部分。选择什么样的溶液？要根据自己的检测要求来定。
常见的是PBS或TBS，还有一些buffer比如碳酸盐，硼酸盐，都是碱性的缓冲液，醋酸盐buffer属于酸性的。
记住如果检测磷酸化蛋白，或用于碱性磷酸酶系统，不要用PBS。具体的使用还得在实战中进行摸索。
还有一类特殊的封闭剂属于特殊的有针对性的的封闭，的就是HAMA。
免疫分析中出现问题的一个常见原因是干扰性抗体，如众所周知的人抗鼠抗体（Human anti-mouse Antibodies，HAMA）、一般的抗动物抗体、嗜异性抗体（Id）或类风湿因子（rheumatoid factors，RF）。
一般来说，这些抗体干扰主要发生在夹心法的免疫分析中，即基于捕获抗体和检测抗体。干扰性抗体可以交联捕获抗体和检测抗体，导致假阳性结果。
或者，它们可以阻止抗原与检测抗体的结合，甚至引起检测抗体的聚集，导致假阴性结果。由于这种封闭剂的针对性很强，一般情况下都称之为“阻断剂”，中文用词讲究。
在分子生物学实验中还有一个常用的，也很奇葩的封闭剂，就是鲑鱼的精子DNA。也不知道是谁先想出来的.......
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