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琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测

阅读次数:368   发布时间:2023/1/6 13:27:26

一. 实验目的

1、掌握琼脂糖凝胶电泳的原理;

2、学习琼脂糖凝胶电泳的操作。

二. 实验原理

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,沸水中溶解,45℃开始形成多孔性刚性滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。不同DNA,其分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应,迁移速度与分子量的对数值成反比关系。

溴化乙锭(EB)未扁平状分子,在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物,其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上,且荧光强度与DNA含量成正比。

三、仪器和试剂

仪器: 微量移液器,电泳仪,电泳槽,微波炉

试剂: 琼脂糖:1.0%;电泳缓冲液(50 × TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g ,冰醋酸5.7ml , 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ,加蒸馏水至100ml ) EB:5 ?l / 100 ml TBE

电泳材料:标准分子量核酸(DL2000)

四. 操作步骤

(1)制胶(以20 mL为例)

a. 称取0.2 g 琼脂糖,加入20 ml 的1XTAE缓冲液(pH 8.0),摇匀;

b. 微波炉加热,至琼脂糖完全溶解(要防止过热溢出三角瓶);

c.将制胶板放入制胶槽中,插入适当的梳子,将溶解的琼脂糖(约50℃)加入2ul EB后,混均匀,倒入其中,直至厚度为4~6 mm(如有气泡要把气泡赶出),在室温下冷却凝固(约30~ 45 min);

d.小心垂直向上拔出梳子,以保证点样孔完好,将胶板置于电泳槽中。

(2)点样

用微量移液器将5 ?l含蓝色染液的 DL2000 加入点样孔下部。

(3)电泳

打开电源开关,调节电压至3~5 V/cm(约100 V),可见到溴酚蓝条带由负向正移动,约30-40分钟后即可观察结果。

(4)观察

将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上,打开紫外灯,可见到橙红色核酸条带,根据条带粗细,可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳,则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。

五、实验结果

点样时效果较好的照片点出的白色荧光线比较亮,条带粗细均匀;条带没有出现两端粗中间细的情况

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