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免疫球蛋白提取分离纯化技术
阅读次数：408 发布时间：2022/12/15 11:37:45
实验概要
免疫球蛋白(Immunoglobulin Ig)的含量代表着机体体液免疫的水平，并进一步代表着B细胞的功能，因此测定血清Ig含量可以推知机体的体液免疫功能和诊断某些疾病引起的Ig的过高和过低。本实验对禽血清IgG和IgA进行了分离纯化。
实验原理
免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。随着免疫学的发展和需要，免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多，有单一法，但大多数采用二步法以上相结合的方法，特别是以硫酸铵提纯为基础，再经过层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度为常用。
硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来(称为盐析)。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同，利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。盐析只能粗提，为了获得纯化的免疫球蛋白成分，必须进一步采用层析的方法进行分离。
主要试剂
1. 禽血清IgG的分离与提纯(Na2SO4法)
1) 5％葡聚糖硫酸盐
2) 0.02Mol/L MnCl2溶液
3) 无水硫酸钠
4) pH8.2硼酸盐缓冲液
5) 0.06Mol/L pH7.4PB液
2. 禽IgA提取与纯化
1) 禽胆汁
2) 饱和硫酸铵溶液
3) 0.01Mol/L pH7.4PBS液
4) 0.10Mol/L pH6.4PBS液(0.30Mol/L NaCl)
5) DEAE52-纤维素
实验步骤
1. 禽血清IgG的分离与提纯(Na2SO4法)
1) 取禽血清10ml加5％葡聚糖硫酸盐液，0.40ml和0.025Mol/L MnCl21.00ml充分混合，静置，然后离心去沉淀，此步目的是为了去掉脂类物质。
2) 于上清液中加无水硫酸钠使每毫升血清含0.18g，缓慢加入，混匀，静置30min，3 000r/min离心去上清。
3) 以pH8.2硼酸盐缓冲液将沉淀稀释至原血清的一半再加硫酸钠使成0.16g／ml，同上法离心去上清。
4) 重复步骤3，加Na2SO4，使成0.14g/ml。
5) 以少量硼酸盐缓冲液溶解沉淀，然后装透析袋除盐48h。
6) 过SephadexG200柱，收集峰和第二峰。峰是IgM，第二峰主要是IgG。
7) 如要进一步提纯，则用第二峰再过DEAE—纤维素柱，以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脱，洗脱下来的蛋白液即为IgG。
也可以按以下操作方法进行：
1) 以18％硫酸钠(W/V)提取一次，再以14％的硫酸钠提取一次。
2) 将粗提的免疫球蛋白以PBS溶解，按9％加入无水硫酸钠，离心。再将上清按5％加入无水硫酸钠，离心。将两沉淀溶解、混合，在常水中透析过夜，再在生理盐水中4℃透析，直至无SO42-为止。
3) 离心将上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。
4) 过SephadexG200柱，以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脱，收集洗脱液，取第二峰即为鸡IgG。
2. 禽IgA提取与纯化
1) 取冷藏的胆汁3ml，缓慢滴加1ml饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使成25％饱和硫酸铵液。4℃放置30min。
2) 3000r/min离心30min，去沉淀。
3) 取上清，加饱和硫酸铵液，使成35％的饱和度，4℃放置30min。
4) 3000r/min离心30min，弃上清。
5) 取沉淀，加0.85％NaCl液溶解，加饱和硫酸铵溶液，重复步骤3和4三次。
6) 将沉淀用0.85％NaCl液溶解，装入透析袋，以0.01Mol/L pH7.4PBS液透析。
7) 以0.01Mol/L pH7.4PBS液平衡，过DEAE52纤维柱(20×250mm)。
8) 取透析样品4ml(﹥20mg/ml蛋白浓度)加入层析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱。
9) 再用0.10Mol/L pH6.4PBS液(NaCl浓度为0.30Mol/L)洗脱，收集洗脱液。
10) 浓缩洗脱蛋白液至20mg/ml，分装，低温冰箱保存。
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