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琼脂糖凝胶电泳法检测DNA及RNA的纯度及浓度
阅读次数：710 发布时间：2022/11/16 11:20:19
1、DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测
（1）配制琼脂糖凝胶
①称取适量琼脂糖，放入100mL锥形瓶中按胶浓度加入1倍 TAE 或 TBE 缓冲液，于微波炉或水浴中溶解。
②熔化的琼脂糖冷却至60℃，加入终浓度为0.5μg/mL 的 EB，混匀。
③将凝胶床水平放置，插入两端的挡板，用滴管吸取少量的凝胶封好胶床边缘。
④放入梳子，使梳齿高于底板0.5～1.0mm。
⑤倒入琼脂糖凝胶溶液，其厚度为3～5mm，放置30～60min，使胶完全硬化。
⑥去掉两端的挡板，将胶床放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，液面高出胶面1～2mm 小心拔出梳子，检查样品孔是否完整。
（2）点样
①取浓度为 1μg/μL 的 DNA 样品5μL，与 5μL 溴酚蓝于封口膜上混合。
②用 20μL 的移液器将样品加入样品孔内。操作时，可用右手持移液器，左手握住右手腕，左肘支撑桌面，防止点样时右手晃动。
③同样操作点上 DNA 分子量标准物。
（3）电泳
将电泳槽置冰箱或冷室中，盖上电泳槽盖，接通电源，样品端接负（DNA 向阳移动），以 5V/cm 电压电泳。
（4）溴酚蓝泳动至胶3/4距离时，可停止电泳，取出凝胶，置短波紫外线（254nm）下观察。植物 DNA 样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带，与分子量标准物的迁移率相比大致估计所提 DNA 的相对分子质量大小。
DNA 样品纯度植物总（核）DNA 样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带，质粒 DNA 应呈现三条不同构型的条带，这时表明所提样品较纯。如果在溴酚蓝有弥散的荧光区出现，则表明样品中存有 RNA 杂质，若所提总 DNA 或核 DNA 在0.5％琼脂糖凝胶上不能形成清晰的条带，而只是弥散一片，则表明 DNA 已严重降解。若所提质粒 DNA 样品在质粒条带上端还有荧光条带（迁移率小于质粒 DNA 条带），表明质粒 DNA 样品中有染色体DNA 污染。
DNA 分子大小与泳动距离相同的标准 DNA 条带的相对分子质量相近。
DNA 样品量比较被测 DNA 样品条带与标准 DNA 样品条带的荧光强度，DNA 量相同时所产生的荧光强度相同。如以 λ-DNA 为标准样品，其浓度为1μg/μL，上样量为 2μL，植物总 DNA 样品条带的亮度与之相近时，其电泳样品量约为2g，根据上样体积可大致估计出样品 DNA 的浓度。对于 λ-DNA 限制性酶切片段的量可将总上样量（xμg）除以总 bp数（约50000bp）再乘上该条带的bp数。
（说明：①配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的 DNA 分子大小来确定。检测植物总 DNA、核 DNA 时，使用0.5％的凝胶；检测大肠杆菌质粒 DNA 时，使用0.8％～1.0％的凝胶。
②制备0.5％以下低浓度凝胶时，可先于胶床上制1％的支持胶，待其固化后将低浓度的胶制于其上，以增加凝固强度；
③若所提总 DNA 或核 DNA 在0.5％琼脂糖凝胶上不能形成清晰的条带，而只是弥散一片，则表明 DNA 已严重降解；
④需要快速检测所提的 DNA 样品时，可采用微型琼脂糖凝胶电泳，配制1％的琼脂糖凝胶10mL，倒在小玻璃板或幻灯片上，自然铺开。梳子用 1mm 厚的有机玻璃制作，齿宽3mm，齿长5mm，齿间距为21nm。点样量为2～5μL，6～7V/cm电压电泳1h检测。
⑤以 λ-DNA 限制性酶切片段为标准样品。
2、RNA 的变性琼脂糖凝胶检测
（1）试剂
①MOPS 缓冲液（10倍）：0.4mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS）（pH7.0），0.1mol/L NaAc，10mol/L EDTA。
②上样染料：50％甘油，1mmol/L EDTA，0.4％溴酚蓝，0.4％二甲苯蓝。
③甲醛。
④甲酰胺（去离子）。
（2）操作
①将制胶用具用70％乙醇冲洗一遍，晾干备用。
②配制琼脂糖凝胶
a.称取 0.5g 琼脂糖，置于干净的 100mL 锥形瓶中，加入 40mL 蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。
b.待胶凉至60～70℃，依次向其中加入9mL甲醛、5mL MOPS 缓冲液（10倍）和 0.5μL 溴化乙锭，混合均匀。
c.灌制琼脂糖凝胶。
③样品准备
a.取 DEPC 处理过的 500μL 离心管，依次加入如下试剂：MOPS 缓冲液（10倍）2μL，甲醛3.5μL，甲酰胺（去离子）10μL，RNA 样品4.5μL，混匀。
b.将离心管置于60℃水浴中保温10min，再置冰上2min。
c.向管中加入 3μL 上样染料，混匀。
④上样（注意点上 RNA 分子量标准物）。
⑤电泳：电泳槽内加入1倍 MOPS 缓冲液，于 7.5V/mL 的电压下电泳。
⑥电泳结束后，在紫外灯下检查结果。
RNA 样品质量不管是变性凝放电泳还是非变性凝胶电泳，完整的总 RNA 样品应呈现出三条条带，为 28SrRNA，18SrRNA，5 SrRNA。其中 8SrRNA 条带的亮度应约为18SrRNA 8条带亮度的两倍，表明 RNA 样品比较完整，无多少降解。如果两条带的亮度反过来了，说明 28SrRNA 已降解成 18S 大小。如无清晰条带，表明样品已严重降解。如果在点样槽内或槽附近有荧光区带，则表明 RNA 样品中有 DNA 污染。
（3）说明
①RNA 电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0％～1.4％的凝胶，不同的RNA 条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA 的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定 RNA 分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总 RNA 样品完整性时，配制普通的1％琼脂糖凝胶即可。
②植物总 RNA 中的 28SrRNA 及 18SrRNA 在变性凝胶上的迁移率相当于分子量 5.1kb 及2.0kbRNA 的迁移率。
（1）配制琼脂糖凝胶
①称取适量琼脂糖，放入100mL锥形瓶中按胶浓度加入1倍 TAE 或 TBE 缓冲液，于微波炉或水浴中溶解。
②熔化的琼脂糖冷却至60℃，加入终浓度为0.5μg/mL 的 EB，混匀。
③将凝胶床水平放置，插入两端的挡板，用滴管吸取少量的凝胶封好胶床边缘。
④放入梳子，使梳齿高于底板0.5～1.0mm。
⑤倒入琼脂糖凝胶溶液，其厚度为3～5mm，放置30～60min，使胶完全硬化。
⑥去掉两端的挡板，将胶床放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，液面高出胶面1～2mm 小心拔出梳子，检查样品孔是否完整。
（2）点样
①取浓度为 1μg/μL 的 DNA 样品5μL，与 5μL 溴酚蓝于封口膜上混合。
②用 20μL 的移液器将样品加入样品孔内。操作时，可用右手持移液器，左手握住右手腕，左肘支撑桌面，防止点样时右手晃动。
③同样操作点上 DNA 分子量标准物。
（3）电泳
将电泳槽置冰箱或冷室中，盖上电泳槽盖，接通电源，样品端接负（DNA 向阳移动），以 5V/cm 电压电泳。
（4）溴酚蓝泳动至胶3/4距离时，可停止电泳，取出凝胶，置短波紫外线（254nm）下观察。植物 DNA 样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带，与分子量标准物的迁移率相比大致估计所提 DNA 的相对分子质量大小。
DNA 样品纯度植物总（核）DNA 样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带，质粒 DNA 应呈现三条不同构型的条带，这时表明所提样品较纯。如果在溴酚蓝有弥散的荧光区出现，则表明样品中存有 RNA 杂质，若所提总 DNA 或核 DNA 在0.5％琼脂糖凝胶上不能形成清晰的条带，而只是弥散一片，则表明 DNA 已严重降解。若所提质粒 DNA 样品在质粒条带上端还有荧光条带（迁移率小于质粒 DNA 条带），表明质粒 DNA 样品中有染色体DNA 污染。
DNA 分子大小与泳动距离相同的标准 DNA 条带的相对分子质量相近。
DNA 样品量比较被测 DNA 样品条带与标准 DNA 样品条带的荧光强度，DNA 量相同时所产生的荧光强度相同。如以 λ-DNA 为标准样品，其浓度为1μg/μL，上样量为 2μL，植物总 DNA 样品条带的亮度与之相近时，其电泳样品量约为2g，根据上样体积可大致估计出样品 DNA 的浓度。对于 λ-DNA 限制性酶切片段的量可将总上样量（xμg）除以总 bp数（约50000bp）再乘上该条带的bp数。
（说明：①配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的 DNA 分子大小来确定。检测植物总 DNA、核 DNA 时，使用0.5％的凝胶；检测大肠杆菌质粒 DNA 时，使用0.8％～1.0％的凝胶。
②制备0.5％以下低浓度凝胶时，可先于胶床上制1％的支持胶，待其固化后将低浓度的胶制于其上，以增加凝固强度；
③若所提总 DNA 或核 DNA 在0.5％琼脂糖凝胶上不能形成清晰的条带，而只是弥散一片，则表明 DNA 已严重降解；
④需要快速检测所提的 DNA 样品时，可采用微型琼脂糖凝胶电泳，配制1％的琼脂糖凝胶10mL，倒在小玻璃板或幻灯片上，自然铺开。梳子用 1mm 厚的有机玻璃制作，齿宽3mm，齿长5mm，齿间距为21nm。点样量为2～5μL，6～7V/cm电压电泳1h检测。
⑤以 λ-DNA 限制性酶切片段为标准样品。
2、RNA 的变性琼脂糖凝胶检测
（1）试剂
①MOPS 缓冲液（10倍）：0.4mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS）（pH7.0），0.1mol/L NaAc，10mol/L EDTA。
②上样染料：50％甘油，1mmol/L EDTA，0.4％溴酚蓝，0.4％二甲苯蓝。
③甲醛。
④甲酰胺（去离子）。
（2）操作
①将制胶用具用70％乙醇冲洗一遍，晾干备用。
②配制琼脂糖凝胶
a.称取 0.5g 琼脂糖，置于干净的 100mL 锥形瓶中，加入 40mL 蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。
b.待胶凉至60～70℃，依次向其中加入9mL甲醛、5mL MOPS 缓冲液（10倍）和 0.5μL 溴化乙锭，混合均匀。
c.灌制琼脂糖凝胶。
③样品准备
a.取 DEPC 处理过的 500μL 离心管，依次加入如下试剂：MOPS 缓冲液（10倍）2μL，甲醛3.5μL，甲酰胺（去离子）10μL，RNA 样品4.5μL，混匀。
b.将离心管置于60℃水浴中保温10min，再置冰上2min。
c.向管中加入 3μL 上样染料，混匀。
④上样（注意点上 RNA 分子量标准物）。
⑤电泳：电泳槽内加入1倍 MOPS 缓冲液，于 7.5V/mL 的电压下电泳。
⑥电泳结束后，在紫外灯下检查结果。
RNA 样品质量不管是变性凝放电泳还是非变性凝胶电泳，完整的总 RNA 样品应呈现出三条条带，为 28SrRNA，18SrRNA，5 SrRNA。其中 8SrRNA 条带的亮度应约为18SrRNA 8条带亮度的两倍，表明 RNA 样品比较完整，无多少降解。如果两条带的亮度反过来了，说明 28SrRNA 已降解成 18S 大小。如无清晰条带，表明样品已严重降解。如果在点样槽内或槽附近有荧光区带，则表明 RNA 样品中有 DNA 污染。
（3）说明
①RNA 电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0％～1.4％的凝胶，不同的RNA 条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA 的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定 RNA 分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总 RNA 样品完整性时，配制普通的1％琼脂糖凝胶即可。
②植物总 RNA 中的 28SrRNA 及 18SrRNA 在变性凝胶上的迁移率相当于分子量 5.1kb 及2.0kbRNA 的迁移率。
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