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琼脂糖凝胶电泳技术要注意的小细节

阅读次数：404 发布时间：2022/11/8 11:42:27

琼脂糖凝胶电泳是利用DNA、RNA分子带负电荷磷酸基团的特性，通过电流使得片段大小不同的核酸由负的凝胶孔中缓慢向正移动，终达到分离核酸分子的技术。由于分子量小的核酸片段在凝胶中移动速度较快，分子量大的核酸片段移动相对较慢的特点，就可以将分子量不同的核酸片段区分开，再结合DNA Marker，即DNA分子量固定已知的标准品进行分析，就可以准确识别和判断核酸片段大小，也就是跑出来的“小东西”到底是不是我们想要的目的基因。

琼脂糖凝胶电泳技术目在生物学科中有非常广泛的应用，但是在这个过程中有几点小细节还需要我们多多注意哦：

①琼脂糖凝胶制备。在制备之，我们先要确定琼脂糖凝胶浓度，当我们需要跑小片段核酸时，就需要制备浓度较高的琼脂糖凝胶，这样DNA片段跑起来的阻力变大，速度变慢，反之亦然。通常情况下，琼脂糖凝胶的浓度在1%左右，即1克琼脂糖与100毫升电泳缓冲液混匀制成，二者体积总和不要超过锥形瓶的三分。摇晃混匀后用微波炉加热到微沸状态，摇匀后继续加热至微沸状态，再次摇匀，反复多次，直至溶液变的清澈明亮。避免溶液暴沸的情况出现，以免影响跑胶效果。冷水冲洗瓶壁略微降温后添加适量核酸染料，摇匀倒入插入梳子的模具中，等待30-60 min凝胶完全凝固即可，尽量在3小时内使用完毕。

②样品准备。样品在从PCR仪中取出后不要急于点样，因为样品刚取出时管内液体和气体温度很高，非常活跃，马上开盖会造成扩增产物弥散到空气中，造成实验室气溶胶污染。所以可以在-20℃冷却5 min，或在4℃冷却20 min再离心上样。样品上样需要加入上样缓冲液，混匀后取适当的量（5-10微升）缓慢注入梳子孔中，由于上样缓冲液的作用，我们可以清晰看见样品注入的过程，与电泳过程中核酸移动的距离。

③电泳。凝胶带孔的一侧放入负一侧，因为核酸样品由负移动向正，负一般用黑色表示。电泳槽倒入与凝胶相同的电泳缓冲液，确保电泳槽液面可以没过凝胶表面。必须注意点样开始和完毕后尽量不要移动电泳槽，以免造成样品扩散到电泳液中。点样完毕后静置2 min，如若样品过多，需要加快点样速度，避免先点的样品扩散，影响条带结果。上述工作完成后盖严电泳槽盖，打开电源，电压设置120V左右，跑胶20-30 min即可。注意观察凝胶上染料移动位置，进而减少或增加时间。

④结果判读。取出凝胶放在切胶仪或凝胶成像分析仪上，用紫外灯照射观察、拍照留存条带结果。根据DNA Marker的条带位置比照分析，得出目的条带的位置（大小）、亮度（数量）和非特异性扩增（扩增效果）。

结合上面的介绍，你有没有存在日常操作中对小细节的疏忽呢？琼脂糖凝胶电泳从制备、上样、电泳和结果判读，每一步环环相扣，一点点问题都会体现在终的结果上。在实验中为了更好的实验效果，岑特生物推出琼脂糖、TAE速溶粉末，核酸染料，上样缓冲液等全套琼脂糖凝胶电泳所需试剂，更有含染料的Taq酶预混液，不用再去加上样缓冲液啦！扩增完成即可直接点样，省时省力，避免污染！