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岑特分享：RT-PCR的定义与检测方法

阅读次数：512 发布时间：2022/10/18 11:10:53

　　1.定义：是以RNA为模板，联合逆转录反应（reverse transcription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。

　　RNA扩增包括两个步骤：在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA；加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，后扩增靶DNA。

　　2.检测方法

　　⑴一步法：

　　利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP直接进行mRNA反转录与PCR扩增。Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检

　　测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA.该法可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。

　　⑵两步法：

　　由于单管反应时RT和PCR都不能在佳条件下进行并且容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因，及定量PCR.两步法则是将RT和PCR分别进行，这样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨，适合那些GC含量、二结构严重的模板或者是未知模板，以及多个基因的RT-PCR。