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提取RNA时如何去除DNA的污染？
阅读次数：489 发布时间：2022/10/10 11:33:00
提取RNA时如何去除DNA的污染的方法：
注意实验室的标准化问题，注意污染的存在，同时严格按照说明书上的操作应该没有问题。发现DNA污染，用DNAse I 消化1小时，37度离心取上清的时候，一定要小心不要取到中间的膜和下面的液体。直接加NaOH溶液与提取液混合搅拌,然后离心就可以了.因为RNA可溶于NaOH溶液,而DNA不可溶,离心后的上清液就不含有DNA了。
RNA提取步骤：
1. 匀浆处理：
① 组织 将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。
② 单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
③ 细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106 动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2. 将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯/仿，剧烈振荡15，室温放置3分钟。
5. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。
6. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
7. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
8. 用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。
9. 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可。不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5%SDS，用枪头吸打几次，55-60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。
注意事项：
从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响链的合成，也不影响PCR反应。
匀浆后加氯/仿之样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。
预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：
肝和脾6-10μg，肾3-4μg，骨骼肌和脑组织1-1.5μg，胎盘1-4μg，上皮细胞8-15μg，成纤维细胞5-7μg 。
注意实验室的标准化问题，注意污染的存在，同时严格按照说明书上的操作应该没有问题。发现DNA污染，用DNAse I 消化1小时，37度离心取上清的时候，一定要小心不要取到中间的膜和下面的液体。直接加NaOH溶液与提取液混合搅拌,然后离心就可以了.因为RNA可溶于NaOH溶液,而DNA不可溶,离心后的上清液就不含有DNA了。
1. 匀浆处理：
① 组织 将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。
② 单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
③ 细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106 动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2. 将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯/仿，剧烈振荡15，室温放置3分钟。
5. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。
6. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
7. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
8. 用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。
9. 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可。不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5%SDS，用枪头吸打几次，55-60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。
注意事项：
从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响链的合成，也不影响PCR反应。
匀浆后加氯/仿之样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。
预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：
肝和脾6-10μg，肾3-4μg，骨骼肌和脑组织1-1.5μg，胎盘1-4μg，上皮细胞8-15μg，成纤维细胞5-7μg 。
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