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岑特实验：动物组织中DNA的制备
阅读次数：337 发布时间：2022/4/25 11:24:09
（一）原 理
DNA是所有生物体的基本组成物质。真核生物DNA主要存在于细胞核中。制备DNA时应将细胞核膜打破方能释放出来。
细胞中的DNA和RNA分别与蛋白质相结合，形成脱氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在细胞破碎后，这两种核蛋白将混杂在一起。因此，要制备DNA先要将这两种核蛋白分开。已知这两种核蛋白在不同浓度的盐溶液中具有不同的溶解度，如在0.15mol/L NaC1的稀盐溶液中核糖核蛋白的溶解度大，脱氧核糖核蛋白的溶解度则小（仅约为在纯水中的1%）；而在l mol/L NaCl的浓盐溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在纯水中的2倍，核糖核蛋白的溶解度则明显降低。根据这种特性，调整盐浓度即可把这两种核蛋白分开。因此，在细胞破碎后，用稀盐溶液，反复清洗，所得沉淀即为脱氧核糖核蛋白成分。
分离得到的脱氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质成分变性，让DNA游离出来，再用含有异戊醇的氯仿沉淀除去变性蛋白质。后根据核酸只溶于水而不溶于有机溶剂的特点，加入95%的乙醇即可从除去蛋白质的溶液中把DNA沉淀出来，获得产品。
当细胞破碎时，细胞内的脱氧核糖核酸酶（DNase）立即开始降解DNA，如果在破碎细胞后不及时采取抑制酶活的措施，后将会得不到任何DNA。为此，如在本实验中加入柠檬酸盐、EDTA等螯合剂以除DNase必需的Mg2＋离子，使DNase活性降低，并要求整个分离制备的过程均在4℃以下进行，以减少DNase的降解作用，后加入SDS使所有的蛋白质（包括DNase）变性。当然如果希望获得更大分子的DNA时，则在细胞破碎后，及时加入SDS使蛋白质（包括DNase）变性，并加入蛋白酶K，降解所有的蛋白质成为碎片或氨基酸，及时阻止DNase的降解作用。
DNA分子很大、很长，在水中呈黏稠状，但DNA链的双螺旋结构不宜小角度的折叠，使之DNA分子具有刚性，即分子是僵直的（stiff），小角度的折叠和压挤等剪切力，将使DNA断裂成碎片。为保证获得大分子DNA，操作时应避免急裂振摇，或过大的离心力。转移吸取DNA时不可用过细的吸头，不可猛吸猛放，更不能用细的吸头反复吹吸。
大分子DNA的水溶液呈黏稠状，可以用玻璃棒缠起来。液体DNA只要防止DNase污染和高盐浓度条件下能在液体状态保存；抽干后的固体DNA，性质稳定，可长期保存。
生物体内各部位的DNA是相同的，但取材时以含量丰富的部位为主，如动物的肝脏、脾、肾、血液、精子等。所有材料，必须新鲜及时使用，或放入－20℃冰箱或液氮冷冻保存。
DNA的含量及纯度可用紫外吸收法、定磷法及化学法等测定。
（二）试剂及器材
（1） 0.15mol/L NaCl – 0.015mol/L pH7.0柠檬酸钠溶液：称取8.77g NaCl，4.41g柠檬酸三钠（Na3C6H507 · 2H20），用约800ml蒸馏水溶解后，调节pH至7.0，后定容至1 000ml。
（2） 0.15mol/L NaCl – 0.1mol/L EDTANa2溶液：称取8.77g NaCl，37.2g EDTANa2溶于约800ml蒸馏水中，以NaOH调pH至8.0，后定容至1 000ml。
（3） 5%（W/V）十二烷基硫酸钠（SDS）溶液：称取5g SDS溶于45%（V/V）100ml的乙醇中。
（4） 氯仿– 异戊醇溶液：按氯仿:异戊醇=24:1配制。
（5） pH8.0 TE缓冲液或0.01mol/LNaOH：120mol/L Tris–HCl，lmol/L EDTANa2。或取NaOH 0.4g加蒸馏水至1 000ml。
（6） 95％（V/V）乙醇1 000ml。
（7） 75％（V/V）乙醇1 000ml。
（8） 组织捣碎机。
（9） 玻璃匀浆器。
（10） 冷冻离心机。
（11） 冰、粗盐。
（三）操作
（1） 本实验以兔肝脏作材料（其他动物肝脏也可以）。实验应将兔饥饿24h以上，以避免糖原的干扰。
（2） 用烧杯（500m1）放1/3体积的冰，加入少量水及约20g食盐，制成冰盐水。
（3） 将经过饥饿的兔颈部放血致死，迅速开腹取出肝脏，称取约10g浸入预先在冰盐水中冷却的0.15mol/L NaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液中。除去脂肪、血块等杂物；再用少量溶液反复洗涤几次，直至组织块无血为止。
（4） 将洗净的组织剪成碎块。先加入20m1 0.15mol/L NaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液，放在组织捣碎机中迅速捣成匀浆，再放入玻璃匀浆器中匀浆2～3次，使细胞充分破碎。后加入0.15mol/L NaCl–0.015mol–L柠檬酸钠溶液至50ml。
（5） 匀浆液在4℃ 6 000r／min离心15min，弃上清。在沉淀中加入4倍体积冷的0.15mol/L NaCl–0.015 mol/L柠檬酸钠溶液，搅匀，按上述条件，离心弃上清。如此重复操作2～3次，尽量洗去可溶的部分（目的是什么?）。后弃去上清，留沉淀。
（6） 将沉淀物（约5m1）悬浮于5倍体积的pH8.0，0.015 mol/L NaCl–0.1 mol/L EDTANa2溶液中，搅匀，而后边搅拌边慢慢滴加5%SDS溶液，直至SDS的终浓度达1%为止（应加多少毫升?），此时溶液变得十分黏稠，若不黏稠应重做，然后，加入固体NaCl使终浓度达l mol/L。继续搅拌30～45min，以确保NaCl全部溶解，此时可见溶液由稠变稀薄。
（7） 将上述混合溶液倒于一个300ml的带塞三角瓶中，加入等体积的氯仿– 异戊醇，振荡10min。在室温3 000r/min离心10min（为什么可以在室温操作?），此时可见离心液分为3层：上层为水溶液，中层为变性蛋白块，下层为氯仿– 异戊醇。小心吸取上层水相，记录体积，放入三角瓶中，向水相中，再加入等体积氯仿– 异戊醇，振荡，离心，如此重复抽提2–3次，除净蛋白质。
（8） 后1次离心后，小心吸取上层溶液（不要吸取下层氯仿），记录体积，放入干燥小烧杯中，加入2倍体积预冷的95%乙醇。加时，用滴管吸取乙醇，边加边用玻璃棒慢慢顺一个方向在烧杯内转动，随着乙醇的不断加入可见溶液出现黏稠状物质，并能逐步缠绕于玻璃棒上，此时玻璃棒搅动的目的在于把黏稠丝状物缠在玻璃棒上，直至再无黏稠丝状物出现为止。黏稠丝状物即是DNA。
（9） 将所得的DNA从玻璃棒上取下，用75%乙醇洗2次，置于干燥器中抽干，称取重量，计算产率。
（10） 按200μg/ml的浓度称取一定量DNA，溶于0.01 mol/L NaOH溶液或pH8.0 TE缓冲液中（干燥DNA不易溶解，应在测定几天预先溶解）。
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