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这三种生物技术常用实验你还不会操作？
阅读次数：373 发布时间：2022/3/4 11:27:01
一、总RNA的提取（Trizol法提取）
在收集到生物材料之后，好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1. 提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；
2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；
3. 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；
4. 取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；
5. 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；
6. 让沉淀的RNA在室温下自然干燥；
7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
二、琼脂糖核酸电泳
1. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；
2. 根据欲分离DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般20~30 ml）；
3. 放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；
4. 室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；
5. 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；
6. 在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；
7. 接通电源，红色为正，黑色为负，切记DNA样品由负往正泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60～100V电压，电泳20～40min即可；
8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；
9. 电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。
琼脂糖凝胶浓度 线形DNA的佳分辨范围（bp）
0.5% 1,000～30,000
0.7% 800～12,000
1.0% 500～10,000
1.2% 400～7,000
1.5% 200～3,000
2.0% 50～2,000
三、胶回收纯化DNA
1. 琼脂糖电泳，将特异电泳带用刀切下放入到EP管中，称琼脂糖带的重量；
2. 按照每100mg加400μl的量加入binding buffer，放入到EP管振荡器中，45℃～55℃温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要5分钟）；
3. 取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2分钟，8,000rpm 离心1分钟，弃EP管中的液体，将纯化柱放回EP管中；
4. 加500μl的wash buffer至柱中，8,000rpm 离心1分钟。弃管中的溶液；
5. 重复操作4步的操作1次，后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30，除去痕量的wash buffer；
6. 将纯化柱放入一个新的EP管。加30~40μl H2O或者elution buffer至纯化柱膜的中央，在37℃或50℃下放置2分钟，10,000rpm离心1分钟洗脱DNA，将EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。
7. 注：若想要不电泳而直接纯化DNA溶液，只需要在第2步中按100μl液量加400μl的binding buffer,其余的步骤不变。
在收集到生物材料之后，好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1. 提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；
2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；
3. 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；
4. 取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；
5. 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；
6. 让沉淀的RNA在室温下自然干燥；
7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
二、琼脂糖核酸电泳
1. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；
2. 根据欲分离DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般20~30 ml）；
3. 放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；
4. 室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；
5. 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；
6. 在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；
7. 接通电源，红色为正，黑色为负，切记DNA样品由负往正泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60～100V电压，电泳20～40min即可；
8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；
9. 电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。
琼脂糖凝胶浓度 线形DNA的佳分辨范围（bp）
0.5% 1,000～30,000
0.7% 800～12,000
1.0% 500～10,000
1.2% 400～7,000
1.5% 200～3,000
2.0% 50～2,000
三、胶回收纯化DNA
1. 琼脂糖电泳，将特异电泳带用刀切下放入到EP管中，称琼脂糖带的重量；
2. 按照每100mg加400μl的量加入binding buffer，放入到EP管振荡器中，45℃～55℃温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要5分钟）；
3. 取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2分钟，8,000rpm 离心1分钟，弃EP管中的液体，将纯化柱放回EP管中；
4. 加500μl的wash buffer至柱中，8,000rpm 离心1分钟。弃管中的溶液；
5. 重复操作4步的操作1次，后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30，除去痕量的wash buffer；
6. 将纯化柱放入一个新的EP管。加30~40μl H2O或者elution buffer至纯化柱膜的中央，在37℃或50℃下放置2分钟，10,000rpm离心1分钟洗脱DNA，将EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。
7. 注：若想要不电泳而直接纯化DNA溶液，只需要在第2步中按100μl液量加400μl的binding buffer,其余的步骤不变。
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