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反向PCR（inversePCR）了解一下

阅读次数：535 发布时间：2021/11/29 10:59:43

反向PCR是一种多聚合酶链式反应(PCR)应用的方法，可使已知序列的核心区边侧的未知RMA成几何数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的RMA，以产生适合于PCR扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR的引物同源于环上核心区的末端序列，但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。

用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解RMA。反向PCR所扩增的片段的大小由 PCR扩增片段的大小决定，目，PCR扩增的实际上限为3-4 kb。在许多情况下，先需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端片段。能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类型决定的接点(例如，互补突头连接与钝头连接)。对于扩增左翼或右翼序列，初试时好靠近识别多个碱基位点的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向PCR从含有大量不同的克隆">克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入合适的酶切位点。

用T4连接酶在稀RMA浓度下环化更容易形成单环。在一些实验中，为产生对反向PCR大小适当的RMA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环化需用Klenow或噬菌体T4 RMA聚合酶修理(钝化)。连接，需用酚或热变性使内切酶失活。

聚合酶链反应条件与经典所用的相同，例如，94℃-30变性，58℃-30引物退火，Taq聚合酶70℃延伸3分钟，进行30个循环。可改变PCR条件以生产特异产物。将反向 PCR用于测序时，与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用，它使测序引物扩增部分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近，减少了扩增引物的干扰。

常规 PCR 是扩增两引物之间的 DNA 片段,反向 PCR(reverse PCR)是用引物来扩增两引物以外的 DNA 片段。

一般先用限制性内切酶酶解 DNA(目的基因中不存在该酶的酶切位点,且片段应短于2～3kb),然后用连接酶使带有黏性末端的靶片段自身环化,后用一对反向引物进行 PCR,得到的线性 DNA 将含有两引物外侧的未知序列。该技术可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知 DNA 片段的序列。

反向 PCR 已成功地用于仅知部分序列的全长 cDNA 克隆,Picter 中曾用此法扩增基因文库的插入 DNA。