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实验天天做，蛋白还是表达不好？

阅读次数：437 发布时间：2021/11/19 10:35:23

哺乳动物表达系统克服了原核表达系统翻译后修饰蛋白表达的问题。表达的蛋白具备折叠和修饰的功能，高度人源化，可以用于结构、功能分析。利用哺乳动物细胞表达蛋白通常有两种方式：瞬时表达与稳定转染（构建稳定细胞系）。利用细胞稳定转染将外源基因转染至细胞染色体上，能够长期稳定地生产目的蛋白。但是实验成本高、周期长、操作难度大。

瞬时蛋白表达是指外源基因存在于游离的载体上，并没有转染到细胞的染色体。构建好质粒后，经过细胞复苏、转染、细胞培养、蛋白纯化等步骤即可得到目的蛋白。操作简单，实验成本低，周期短，适合应用于快速、小规模制备一定量的重组蛋白和重组抗体。

快来看看如何提高瞬时蛋白表达吧！

策略一：优化编码序列

根据特定的下游应用设计佳的编码序列并选择合适的表达载体。在开始蛋白表达之，使用密码子优化算法 (如OptimumGene?或GenSmart Codon Optimization) 以及表达载体选择指南 (如金斯瑞的GenSmart? Design工具) 可节省时间、精力和费用。你知道吗？金斯瑞可提供从基因合成（免费的密码子优化）到蛋白表达、纯化等一体化服务！

策略二：提高蛋白溶解度

较低的蛋白质溶解度是造成重组蛋白表达产量低的一个关键因素。我们建议先调整一些常用的表达条件参数来提高蛋白质的溶解度。

温度

对于HEK293和其它哺乳动物细胞系，建议在37°C、5% CO2孵箱中培养细胞。有些研究表明，在转染后24小时将温度从37°C降至33°C培养，可提高HEK293细胞的蛋白表达。

尽管不同供应商提供的基础培养基十分类似，但它们之间的微小差异可能会影响特定表达细胞系的生长。一定要优化外部成分的浓度、pH值、类型甚至是批次或批号，如添加到培养基中的血清。

培养基

培养基添加剂

在某些情况下，我们建议向培养基中添加特定的试剂来提升蛋白表达。例如添加组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，使染色质解聚并增加整合基因的转录活性。或者，向培养基中加入特定的生长因子有助于提高蛋白产量。

策略三：使用融合伴侣

蛋白标签是插入到重组蛋白上的短肽序列，可以用于提高蛋白表达。通常会在蛋白表达结束时采用酶切或化学试剂去除。表1列举了常用的蛋白标签类型及其优缺点。

表1：常用标签列表

针对特定表达系统选择合适的标签取决于多种因素。如果目标是获得高的产量，则需要使用助溶标签，比如GST有很强的翻译起始信号，能促进高水平的表达。但是，如果需要较低的表达水平，建议使用更严格的表位标签，如His标签。

策略四：优化纯化方法

根据下游应用和纯度要求设计不同的纯化方法。如果蛋白表达量高，那么使用一步式亲和纯化方法就能获得足够量和纯度的蛋白，满足各种下游应用。如果需要进一步纯化，亲和纯化后通常可以进行分子排阻色谱(Size Exclusion Chromatography, SEC)。如需更进一步纯化，则可使用离子交换色谱 (Ion Exchange, IEX) 。