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染料配基层析法纯化蛋白质实验
阅读次数：519 发布时间：2021/5/31 13:30:33
染料配基法
实验方法原理
选择纯化特异蛋白质的适宜染料一般是通过反复试验比较后决定。Cibacron Blue F3GA，作为该域的先驱染料与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸很相似，并且一直用于纯化激酶、水解酶、聚合酶和其他核苷酸依赖的蛋白质。但是这种结合特异性不是绝对的，Cibacron Blue 也用于不具有核苷酸结合功能的各种蛋白质的纯化。蛋白质与染料的结合可能涉及疏水、静电或氢键结合力等。
因此，尽管有市售的筛选各种染料的试剂盒，选择纯化给定蛋白质的佳染料也没有现成的方法可楯。Scopes 按照与蛋白质结合的能力将染料分类，并推荐了一个选择有效染料的系统。
染料配基层析的操作比较简单。基于一些支持介质的染料层析柱填料可从市场获得，这些推荐的商品都有很好的可再生性。在选择适宜的染料配基时，非常实用的方法是连续进行几种染料配基层析试验，如果种不结合目的蛋白，也许第二种就会结合。洗脱时，绝大多数蛋白质是采用高盐方式洗脱，虽然后面还提及其他方法。染料配基柱若是与目的蛋白结合能力很有限，则可以降低溶液的pH值或应用二价、三价阳离子时常会得到改善。总之，遵循上述这样几个办法，染料配基层析将在蛋白质纯化中发挥重要作用。
实验材料
蛋白质样品液
试剂、试剂盒 Tris-HCl NaCl NaOH NaN3
仪器、耗材 层析柱
在开始染料配基层析纯化蛋白质之，必须确定所用的染料。如所述，需用不同染料柱进行小规模（1 ml 柱）试验筛选。Scopes 推荐的策略可供参考。此外，进一步的小规模试验可用于优化洗脱参数。有必要提醒注意的是：一个能与许多蛋白质结合而不结合目的蛋白的染料配基柱非常有用。它可以作为终纯化去除杂蛋白的佳步骤。以下介绍 Cibacron Blue F3GA 柱用高盐溶液洗脱的方案。
1. 用5 ml Cibacron Blue F3GA-琼脂糖装填一个层析柱。对大多数实际应用来讲，短而粗的柱子应能获得满意效果。长而细的柱子多用于纯化结合力弱的蛋白质，虽然流速会有所下降；
2. 10 倍柱床体积的层析缓冲液（例如，20 mmol/L，pH 8.0 Tris-HCl，０.1 mol/L NaCl） 平衡装好的柱子；
3. 为了达到上样要求，蛋白质样品液需转换成近似层析缓冲液的条件，即通过用层析缓冲液透析或 1：1 稀释来进行。上样样品液应经离心或过滤达到澄淸。5 ml 柱子能上样 50～200 mg 蛋白质样品。除非蛋白质结合容量非常高，通常上样蛋白质浓度应在 10～20 mg/ml 范围；
4. 上样到层析柱；
5. 5 倍柱床体积层析缓冲液洗柱或洗至 A280 值回到基线；
6. 5 倍柱床体积洗脱缓冲液（例如，20 mmol/L，pH 8.0 Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl） 洗脱目的蛋白；
7. 检测洗脱组分中的目的蛋白，并汇集含活性目的蛋白的组分；
8. 再生层析柱。先用 3 倍柱床体积 1 mmol/L NaOH洗柱，再用 10 倍体积含 0.02％ NaN3 的层析缓冲液洗柱即可。
实验方法原理
选择纯化特异蛋白质的适宜染料一般是通过反复试验比较后决定。Cibacron Blue F3GA，作为该域的先驱染料与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸很相似，并且一直用于纯化激酶、水解酶、聚合酶和其他核苷酸依赖的蛋白质。但是这种结合特异性不是绝对的，Cibacron Blue 也用于不具有核苷酸结合功能的各种蛋白质的纯化。蛋白质与染料的结合可能涉及疏水、静电或氢键结合力等。
因此，尽管有市售的筛选各种染料的试剂盒，选择纯化给定蛋白质的佳染料也没有现成的方法可楯。Scopes 按照与蛋白质结合的能力将染料分类，并推荐了一个选择有效染料的系统。
染料配基层析的操作比较简单。基于一些支持介质的染料层析柱填料可从市场获得，这些推荐的商品都有很好的可再生性。在选择适宜的染料配基时，非常实用的方法是连续进行几种染料配基层析试验，如果种不结合目的蛋白，也许第二种就会结合。洗脱时，绝大多数蛋白质是采用高盐方式洗脱，虽然后面还提及其他方法。染料配基柱若是与目的蛋白结合能力很有限，则可以降低溶液的pH值或应用二价、三价阳离子时常会得到改善。总之，遵循上述这样几个办法，染料配基层析将在蛋白质纯化中发挥重要作用。
实验材料
蛋白质样品液
试剂、试剂盒 Tris-HCl NaCl NaOH NaN3
仪器、耗材 层析柱
在开始染料配基层析纯化蛋白质之，必须确定所用的染料。如所述，需用不同染料柱进行小规模（1 ml 柱）试验筛选。Scopes 推荐的策略可供参考。此外，进一步的小规模试验可用于优化洗脱参数。有必要提醒注意的是：一个能与许多蛋白质结合而不结合目的蛋白的染料配基柱非常有用。它可以作为终纯化去除杂蛋白的佳步骤。以下介绍 Cibacron Blue F3GA 柱用高盐溶液洗脱的方案。
1. 用5 ml Cibacron Blue F3GA-琼脂糖装填一个层析柱。对大多数实际应用来讲，短而粗的柱子应能获得满意效果。长而细的柱子多用于纯化结合力弱的蛋白质，虽然流速会有所下降；
2. 10 倍柱床体积的层析缓冲液（例如，20 mmol/L，pH 8.0 Tris-HCl，０.1 mol/L NaCl） 平衡装好的柱子；
3. 为了达到上样要求，蛋白质样品液需转换成近似层析缓冲液的条件，即通过用层析缓冲液透析或 1：1 稀释来进行。上样样品液应经离心或过滤达到澄淸。5 ml 柱子能上样 50～200 mg 蛋白质样品。除非蛋白质结合容量非常高，通常上样蛋白质浓度应在 10～20 mg/ml 范围；
4. 上样到层析柱；
5. 5 倍柱床体积层析缓冲液洗柱或洗至 A280 值回到基线；
6. 5 倍柱床体积洗脱缓冲液（例如，20 mmol/L，pH 8.0 Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl） 洗脱目的蛋白；
7. 检测洗脱组分中的目的蛋白，并汇集含活性目的蛋白的组分；
8. 再生层析柱。先用 3 倍柱床体积 1 mmol/L NaOH洗柱，再用 10 倍体积含 0.02％ NaN3 的层析缓冲液洗柱即可。
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