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支原体污染的特点及检验方法

阅读次数：572 发布时间：2021/4/30 11:52:00

支原体是种大小介于细菌和病毒之间(小直径0.2um)并独立生活的微生物。约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性。可为圆形、丝状或梨形。

支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构。其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。

支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、O2或葡萄糖，每种支原体都有自身持点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7.6—8.0)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对般抗生素不敏感。

支原体污染细胞后。培养液可不发生混浊。多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解。因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢。甚至从培养器皿脱落。

为确定有无支原体污染可做如下检测：

①相差显微境检测：将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察。支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。

②荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满取出玻片，用不合酚红的 Hanks液漂洗下，用1:3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗。置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min。向细胞面滴加pH5.5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。

③电镜检查；用扫描电镜方法简便快速。也可以利用透射电镜。

④DNA分子条文检查或支原体培养等方法：检出率高。但方法较为复杂

支原体是类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小般在0.3-0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于细胞，也不同于病毒。支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长，营养要求比细菌高。

细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个性问题。在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，支原体感染发生后能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达，又不能通过可视法对其进行检测，而且它对细胞的生长率影响较小，不易引起注意。国内外研究表明，95％以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆支原体（A.laidlawii），为牛源性。以上是常见的污染细胞培养的支原体菌群，但能够污染细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。

支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。