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手把手教你攻克PCR困难模板 @岑特技术
阅读次数：459 发布时间：2021/3/5 11:17:01
PCR算是实验室磨练耐心的实验之了，好不容易完成了样品准备、核酸的提取，然而PCR之后没有产物，是漏加了试剂，还是酶失活？换上新试剂，格外小心，重来次，没用啊！，依然P不出条带。内心无比凄凉，悲伤逆流成河。
本来做个PCR研究都够难了，现在还偏要碰到“困难模板”，小白不哭，没有条带不要着急，古朵生物总结经验，带你攻克各路PCR困难模板。
高GC含量模板
难点
DNA序列中，G-C之间的三对氢键通常需要较高能量解链，模板很难打开，易形成复杂的二结构，DNA聚合酶难以推进。因此高GC含量（G+C>=60%）DNA序列在常规PCR条件下比较难扩增。
解决方案
选用门针对GC-RICH PCR系统试剂盒：
包含高合成能力的DNA聚合酶，这类酶对DNA模板的亲和力较高，更适合扩增困难靶标
添加1~2M betaine：
betaine在PCR混合液里可以保护DNA聚合酶免被高温变性伤害，还能促进DNA-蛋白质复合物的稳定，提高扩增效率。
添加2~5% DMSO：
DMSO可以降低DNA的二结构。但DMSO也会降低Taq polymerase的活性，因此DMSO的使用浓度需要优化。
长片段模板
难点
长片段DNA序列在PCR过程中易损伤，使其断裂或脱嘌呤，导致长片段PCR无法进行。Taq酶具有定的错配率，导致产物链3‘端出现错配碱基，链合成提终止。非特异性扩增也会干扰长片段的延伸。
解决方案
使用为长片段PCR设计的PCR系统试剂盒：包含兼具矫正功能的DNA酶和高合成能力的DNA聚合酶，这类酶能够在短时间内扩增长片段。
设计较长的长片段PCR引物（21~34bp），提高反应特异性，减少错配率。
适当降低延伸温度，同时根据模板长度加长延伸反应时间（通常1kb/min）。
缓冲液体系需提高Tris的浓度或改用Tricine缓冲液以增强缓冲能力，使缓冲液的pH不会降的过低而影响酶活性。
低纯度模板
A picture containing indoor, sitting, table, red Description automatically generated
难点
低纯度模板中可能含有PCR抑制剂残留，如蛋白酶K、苯酚和EDTA；残留的盐分或离子，如K+，Na+等也可能会抑制DNA聚合酶，从而影响PCR扩增。
解决方案
选择合成能力高，对抑制剂耐受力高的DNA聚合酶，比如，把野生型Ta酶通过Directed Evolution工程化修饰的KAPA2G DNA聚合酶。
使用70%乙醇再纯化DNA，去除残留盐分或离子。
把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
若存在EDTA或其它金属螯合剂时，需要适当提高能与EDTA结合的 Mg2+浓度。
低浓度模板
A picture containing animal, holding, racket, piece Description automatically generated
难点
模板浓度是决定Ct的主要因素，需控制在个合适范围内，使Ct在15-35之间。低浓度模板不仅会影响PCR效率降低得率，甚至无扩增产物。
解决方案
选择高灵敏度，高合成能力的DNA聚合酶。
避免样制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
再次扩增PCR产物，得到更高的目标DNA得率。
PCR扩增无产物时，可以适当提高Mg2+浓度（终浓度范围：1~4 mM）。
本来做个PCR研究都够难了，现在还偏要碰到“困难模板”，小白不哭，没有条带不要着急，古朵生物总结经验，带你攻克各路PCR困难模板。
高GC含量模板
难点
DNA序列中，G-C之间的三对氢键通常需要较高能量解链，模板很难打开，易形成复杂的二结构，DNA聚合酶难以推进。因此高GC含量（G+C>=60%）DNA序列在常规PCR条件下比较难扩增。
解决方案
选用门针对GC-RICH PCR系统试剂盒：
包含高合成能力的DNA聚合酶，这类酶对DNA模板的亲和力较高，更适合扩增困难靶标
添加1~2M betaine：
betaine在PCR混合液里可以保护DNA聚合酶免被高温变性伤害，还能促进DNA-蛋白质复合物的稳定，提高扩增效率。
添加2~5% DMSO：
DMSO可以降低DNA的二结构。但DMSO也会降低Taq polymerase的活性，因此DMSO的使用浓度需要优化。
长片段模板
难点
长片段DNA序列在PCR过程中易损伤，使其断裂或脱嘌呤，导致长片段PCR无法进行。Taq酶具有定的错配率，导致产物链3‘端出现错配碱基，链合成提终止。非特异性扩增也会干扰长片段的延伸。
解决方案
使用为长片段PCR设计的PCR系统试剂盒：包含兼具矫正功能的DNA酶和高合成能力的DNA聚合酶，这类酶能够在短时间内扩增长片段。
设计较长的长片段PCR引物（21~34bp），提高反应特异性，减少错配率。
适当降低延伸温度，同时根据模板长度加长延伸反应时间（通常1kb/min）。
缓冲液体系需提高Tris的浓度或改用Tricine缓冲液以增强缓冲能力，使缓冲液的pH不会降的过低而影响酶活性。
低纯度模板
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难点
低纯度模板中可能含有PCR抑制剂残留，如蛋白酶K、苯酚和EDTA；残留的盐分或离子，如K+，Na+等也可能会抑制DNA聚合酶，从而影响PCR扩增。
解决方案
选择合成能力高，对抑制剂耐受力高的DNA聚合酶，比如，把野生型Ta酶通过Directed Evolution工程化修饰的KAPA2G DNA聚合酶。
使用70%乙醇再纯化DNA，去除残留盐分或离子。
把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
若存在EDTA或其它金属螯合剂时，需要适当提高能与EDTA结合的 Mg2+浓度。
低浓度模板
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难点
模板浓度是决定Ct的主要因素，需控制在个合适范围内，使Ct在15-35之间。低浓度模板不仅会影响PCR效率降低得率，甚至无扩增产物。
解决方案
选择高灵敏度，高合成能力的DNA聚合酶。
避免样制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
再次扩增PCR产物，得到更高的目标DNA得率。
PCR扩增无产物时，可以适当提高Mg2+浓度（终浓度范围：1~4 mM）。
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