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细胞培养中支原体污染的预防和清除
阅读次数：604 发布时间：2020/10/20 10:55:46
支原体污染是细胞培养中一个很常见的问题，可能有高达87%的细胞系发生过支原体污染。支原体是一种直径约为0.2-0.8 μm，无细胞壁的原核生物，具有变形能力，可透过常见过滤膜（0.22-0.45 μm），常规的无菌过滤方法不能将其去除，细胞培养常用的青霉素和链霉素也不能清除培养物中的支原体。支原体污染能改变细胞的DNA、RNA和蛋白质的合成，引起染色体异常，尤其是会改变宿主细胞表面膜蛋白抗原性。
由于支原体污染能影响几乎每一个细胞参数，所以很多研究都强调常规筛选研究细胞系的需要，以确保观察到的结果不被污染所损害。
一，支原体污染的预防
预防是防止细胞培养过程中发生污染的办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到*小程度。一般预防可从以下几方面着手。
1．从物品、用品消毒灭菌着手
细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。
2、从操作者做起
（1）操作者责任心要强，要细心稳重，操作技术要熟练。进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟，按规定穿隔离衣。进入后关好门，坐下来尽量少走动。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。事先要严格检查器材、溶液和培养物，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大批污染。
（2）操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。
（3）操作时要常更换吸管，切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾，保持实验室清洁整齐，*后用消毒水浸泡的纱布擦台面。
3．防止细胞交叉污染
（1）在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，做上标记便于辨别。并按顺序进行操作，避免一起进行时易发生混乱。
（2）在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。
（3）所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，均应及早留种冻存，一旦发生污染可弃之复苏，重新培养。
二，支原体污染的清除
培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之。有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。
1．使用抗生素
抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素(青霉素100u/mL加链霉素100μg/mL)，污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍的冲洗法，于加药后作用24～48小时，再换常规培养液。
此法在污染早期可能有效。所用抗生素品种除青霉素、链霉素外，还可用庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四环素、制霉菌素等。常用400～800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四环素处理，每隔2～3日换液1次，传1～2代进行治疗。近年来有报道，4-氟，2-羟基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilinderivative, BM-Cyclin2:BM-1和四环素衍生物(BM-2)等三种抗生素单用或合用对杀灭支原体有效。
2．加温处理
将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。所以在处理前要进行预试验，摸索能限度杀死支原体又对细胞影响*小的加热时间。此法有时不可靠。若先用药物处理后，再以41℃加温处理效果更佳。
3．使用支原体特异性血清
用5%的兔支原体免疫血清(血凝效价1:320以上)可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。但此法比较麻烦，不如用抗生素方便、经济。
4．其他方法
除了上述去除污染的方法外，还有动物体内接种除菌法、巨噬细胞吞噬法、污染培养瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及过滤法等，但均较麻烦，且效果不确定。所以一旦支原体污染，除非有特别重要价值，一般均弃之重新培养。
由于支原体污染能影响几乎每一个细胞参数，所以很多研究都强调常规筛选研究细胞系的需要，以确保观察到的结果不被污染所损害。
一，支原体污染的预防
预防是防止细胞培养过程中发生污染的办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到*小程度。一般预防可从以下几方面着手。
1．从物品、用品消毒灭菌着手
细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。
2、从操作者做起
（1）操作者责任心要强，要细心稳重，操作技术要熟练。进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟，按规定穿隔离衣。进入后关好门，坐下来尽量少走动。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。事先要严格检查器材、溶液和培养物，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大批污染。
（2）操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。
（3）操作时要常更换吸管，切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾，保持实验室清洁整齐，*后用消毒水浸泡的纱布擦台面。
3．防止细胞交叉污染
（1）在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，做上标记便于辨别。并按顺序进行操作，避免一起进行时易发生混乱。
（2）在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。
（3）所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，均应及早留种冻存，一旦发生污染可弃之复苏，重新培养。
二，支原体污染的清除
培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之。有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。
1．使用抗生素
抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素(青霉素100u/mL加链霉素100μg/mL)，污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍的冲洗法，于加药后作用24～48小时，再换常规培养液。
此法在污染早期可能有效。所用抗生素品种除青霉素、链霉素外，还可用庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四环素、制霉菌素等。常用400～800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四环素处理，每隔2～3日换液1次，传1～2代进行治疗。近年来有报道，4-氟，2-羟基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilinderivative, BM-Cyclin2:BM-1和四环素衍生物(BM-2)等三种抗生素单用或合用对杀灭支原体有效。
2．加温处理
将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。所以在处理前要进行预试验，摸索能限度杀死支原体又对细胞影响*小的加热时间。此法有时不可靠。若先用药物处理后，再以41℃加温处理效果更佳。
3．使用支原体特异性血清
用5%的兔支原体免疫血清(血凝效价1:320以上)可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。但此法比较麻烦，不如用抗生素方便、经济。
4．其他方法
除了上述去除污染的方法外，还有动物体内接种除菌法、巨噬细胞吞噬法、污染培养瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及过滤法等，但均较麻烦，且效果不确定。所以一旦支原体污染，除非有特别重要价值，一般均弃之重新培养。
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