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慢病毒包装原理、流程和检测方法
阅读次数：674 发布时间：2020/9/9 10:48:39
一、病毒载体系统
病毒载体介导基因技术，一种的基因转移工具，将外源基因包装到天然病毒的外壳中，利用病毒对宿主细胞的感染性，将外源基因导入特定细胞中，广泛应用于基因诊断和基因治疗。
二、慢病毒包装简介
病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒。慢病毒(Lentivirus)载体是以人类免疫缺陷丨型病毒(HIV-1)为基础发展起来的基因载体。
慢病毒是一种逆转录病毒，能使外源基因整合入宿主的基因组稳定、长期表达，比一般的逆转录病毒具有更高的滴度和更广的宿主范围。携带外源基因的慢病毒载体与包装载体(产生病毒颗粒所需的辅助蛋白)一同转染包装细胞，即可进行病毒的包装；包装好的慢病毒为假型病毒（毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代），然后分泌到细胞外的培养基中，经过离心取得上清液，再浓缩后的慢病毒液可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而实现外源基因在宿主细胞中的表达。
三、慢病毒载体系统
慢病毒载体系统：包装成分和载体成分。
产生慢病毒颗粒的辅助成分：慢病毒包装质粒和包装细胞系。
慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
慢病毒包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。
将包装成分与载体成分的3个质粒共转染包装细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。
四、病毒包装实验步骤
1、目的基因真核表达载体构建流程图
2、质粒DNA和其他包装质粒共转染293T细胞
3、慢病毒感染细胞
感染步骤：
①铺板：将对数生长期的细胞消化重悬后，按1*105/L密度接种于12孔板，生长过夜。
②感染：将70-80%铺满12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入PBS浓度梯度稀释的病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。
③24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体根据细胞状态来看。
4、感染后细胞检测方法
蛋白提取及Western检测
western-Bloting：蛋白免疫印迹，一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上， 用得多的材料是硝酸纤维素膜(NC 膜)和 PVDF 膜， 蛋白转移的方法多用电泳转移 （转移电泳），它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白质表达水平的检测
病毒载体介导基因技术，一种的基因转移工具，将外源基因包装到天然病毒的外壳中，利用病毒对宿主细胞的感染性，将外源基因导入特定细胞中，广泛应用于基因诊断和基因治疗。
二、慢病毒包装简介
病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒。慢病毒(Lentivirus)载体是以人类免疫缺陷丨型病毒(HIV-1)为基础发展起来的基因载体。
慢病毒是一种逆转录病毒，能使外源基因整合入宿主的基因组稳定、长期表达，比一般的逆转录病毒具有更高的滴度和更广的宿主范围。携带外源基因的慢病毒载体与包装载体(产生病毒颗粒所需的辅助蛋白)一同转染包装细胞，即可进行病毒的包装；包装好的慢病毒为假型病毒（毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代），然后分泌到细胞外的培养基中，经过离心取得上清液，再浓缩后的慢病毒液可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而实现外源基因在宿主细胞中的表达。
三、慢病毒载体系统
慢病毒载体系统：包装成分和载体成分。
产生慢病毒颗粒的辅助成分：慢病毒包装质粒和包装细胞系。
慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
慢病毒包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。
将包装成分与载体成分的3个质粒共转染包装细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。
四、病毒包装实验步骤
1、目的基因真核表达载体构建流程图
2、质粒DNA和其他包装质粒共转染293T细胞
3、慢病毒感染细胞
感染步骤：
①铺板：将对数生长期的细胞消化重悬后，按1*105/L密度接种于12孔板，生长过夜。
②感染：将70-80%铺满12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入PBS浓度梯度稀释的病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。
③24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体根据细胞状态来看。
4、感染后细胞检测方法
蛋白提取及Western检测
western-Bloting：蛋白免疫印迹，一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上， 用得多的材料是硝酸纤维素膜(NC 膜)和 PVDF 膜， 蛋白转移的方法多用电泳转移 （转移电泳），它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白质表达水平的检测
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