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神经干细胞的培养步骤
阅读次数：451 发布时间：2020/8/17 10:35:39
实验方法原理：
由于神经干细胞(Neural Stem Cell)具有自我更新和多向分化的潜能，因此，可以采用悬浮神经球培养的方法来获得和研究。即将胚胎脑组织处理成单个细胞后，只有具有自我更新能力的细胞才能在培养液中克隆增殖成为悬浮的神经球，并随着传代的进行，保持增殖能力和向多种神经子代细胞分化的能力。
实验材料：新生SD大鼠
试剂、试剂盒：多聚甲醛 蒸馏水 PBS DAB 血清培养基 多聚赖氨酸 胎牛血清 双蒸水
仪器、耗材：解剖显微镜 眼科剪 吸管 24孔培养板 制冰机 匀浆器
实验步骤：
1.获得特定脑组织。
2.获取单细胞悬液通常有两种方法。机械分离法操作步骤：
①用少量DF12液体覆盖组织，再用虹膜剪剪碎组织块成 1 mm3大小；
②将组织块收集入神经干细胞培养液中；
③用fire-polished巴氏吸管吹吸成单细胞悬液；
④细胞悬液过200目筛网；
⑤离心800r/min,3min,弃上清。
胰酶消化＋胰酶抑制剂终止法操作步骤：
②用虹膜剪剪碎组织块成1mm3大小；
②用0.125%胰酶+0.02%EDTA消化组织，37℃-2min;
③加入胰酶抑制剂终止消化（使用浓度因生产公司不同、抑制剂活性不同而不同，可参考具体说明书）；
④800r/min离心3min,弃上清。
3.用神经干细胞培养液重悬，用fire-polished巴氏吸管吹吸成单细胞悬液，细胞计数，接种，密度为1x105/ml。
4.培养3-4d可以1/2量换液，培养7-10d进行传代。程序：切收集神经球入离心管，800r/min离心3min;
(2)弃上清，加入0.125%胰酶+0.02%EDTA消化组织，37℃孵育3-Smin;
＠加入等体积的1X胰酶抑制剂终止消化；
＠收集细胞入离心管中，800r/min离心3min,弃上清；
＠加入新的神经干细胞培养液重悬，用fire-polished巴氏吸管吹吸成单细胞悬液，细胞计数，接种。
5.培养的神经球可以接种于多聚赖氨酸包被的皿底或玻片上，加入神经干细胞分化液分化诱导，使其向子代细胞分化。由于神经千细胞悬浮培养的方法实际上是回顾性的判断细胞的身份，即只有能够持续传代增殖并向多种方向分化的细胞才是真正的神经于细胞，因此，结果的判读就要结合多种方法综合判断。进行实验的时候也需要通过对照的设置来保证实验的可信度。
注意事项：
1.要注意区分细胞聚集体和克隆球体，可以根据上述结果判读方法进行。
2细胞增殖能力与组织来源动物的年龄以及所取脑区都有很重要的关系。胎龄越小干细胞所处发育状态越幼稚，细胞的增殖能力越强；皮层来源的神经干细胞相比其他脑区更容易获得增殖能力较好的细胞。
3.脑膜组织对于神经干细胞有诱导贴壁和分化的作用，所以，组织处理过程中一定要清除干净脑膜组织等。
4血清对千神经干细胞有诱导分化的作用，所以终止消化时不能使用加有血清的培养液。
5传代的时间一般为7-10d左右，但是如果神经球的体积较大，光镜下观察其中心已经开始出现黑色区域（产生黑色区域的原因可能是因为球体体积过大，影响光线透过，但是此时球体中心也往往会出现死细胞），则要及时传代。
其他：
1.机械法分离获得的细胞容易有细胞聚集，培养得来的球体就有可能不是单细胞克隆体；而消化法的消化液浓度和时间则要根据组织来源动物的不同年龄以及组织来源的不同区域进行调整，摸索*佳消化浓度和时间。
2.由于神经干细胞贴壁后也具有一定的促使分化的作用，所以，培养神经干细胞的皿或瓶用新的无划痕的器皿。
3如果观察到培养过程中出现贴壁细胞，可以通过更换培养瓶的方法来进行挽救，并且发现后越早更换越好。但是如果球体还没有形成，则尽量不要更换器皿和触碰细胞，否则会影响神经球的形成。
由于神经干细胞(Neural Stem Cell)具有自我更新和多向分化的潜能，因此，可以采用悬浮神经球培养的方法来获得和研究。即将胚胎脑组织处理成单个细胞后，只有具有自我更新能力的细胞才能在培养液中克隆增殖成为悬浮的神经球，并随着传代的进行，保持增殖能力和向多种神经子代细胞分化的能力。
实验材料：新生SD大鼠
试剂、试剂盒：多聚甲醛 蒸馏水 PBS DAB 血清培养基 多聚赖氨酸 胎牛血清 双蒸水
仪器、耗材：解剖显微镜 眼科剪 吸管 24孔培养板 制冰机 匀浆器
实验步骤：
1.获得特定脑组织。
2.获取单细胞悬液通常有两种方法。机械分离法操作步骤：
①用少量DF12液体覆盖组织，再用虹膜剪剪碎组织块成 1 mm3大小；
②将组织块收集入神经干细胞培养液中；
③用fire-polished巴氏吸管吹吸成单细胞悬液；
④细胞悬液过200目筛网；
⑤离心800r/min,3min,弃上清。
胰酶消化＋胰酶抑制剂终止法操作步骤：
②用虹膜剪剪碎组织块成1mm3大小；
②用0.125%胰酶+0.02%EDTA消化组织，37℃-2min;
③加入胰酶抑制剂终止消化（使用浓度因生产公司不同、抑制剂活性不同而不同，可参考具体说明书）；
④800r/min离心3min,弃上清。
3.用神经干细胞培养液重悬，用fire-polished巴氏吸管吹吸成单细胞悬液，细胞计数，接种，密度为1x105/ml。
4.培养3-4d可以1/2量换液，培养7-10d进行传代。程序：切收集神经球入离心管，800r/min离心3min;
(2)弃上清，加入0.125%胰酶+0.02%EDTA消化组织，37℃孵育3-Smin;
＠加入等体积的1X胰酶抑制剂终止消化；
＠收集细胞入离心管中，800r/min离心3min,弃上清；
＠加入新的神经干细胞培养液重悬，用fire-polished巴氏吸管吹吸成单细胞悬液，细胞计数，接种。
5.培养的神经球可以接种于多聚赖氨酸包被的皿底或玻片上，加入神经干细胞分化液分化诱导，使其向子代细胞分化。由于神经千细胞悬浮培养的方法实际上是回顾性的判断细胞的身份，即只有能够持续传代增殖并向多种方向分化的细胞才是真正的神经于细胞，因此，结果的判读就要结合多种方法综合判断。进行实验的时候也需要通过对照的设置来保证实验的可信度。
注意事项：
1.要注意区分细胞聚集体和克隆球体，可以根据上述结果判读方法进行。
2细胞增殖能力与组织来源动物的年龄以及所取脑区都有很重要的关系。胎龄越小干细胞所处发育状态越幼稚，细胞的增殖能力越强；皮层来源的神经干细胞相比其他脑区更容易获得增殖能力较好的细胞。
3.脑膜组织对于神经干细胞有诱导贴壁和分化的作用，所以，组织处理过程中一定要清除干净脑膜组织等。
4血清对千神经干细胞有诱导分化的作用，所以终止消化时不能使用加有血清的培养液。
5传代的时间一般为7-10d左右，但是如果神经球的体积较大，光镜下观察其中心已经开始出现黑色区域（产生黑色区域的原因可能是因为球体体积过大，影响光线透过，但是此时球体中心也往往会出现死细胞），则要及时传代。
其他：
1.机械法分离获得的细胞容易有细胞聚集，培养得来的球体就有可能不是单细胞克隆体；而消化法的消化液浓度和时间则要根据组织来源动物的不同年龄以及组织来源的不同区域进行调整，摸索*佳消化浓度和时间。
2.由于神经干细胞贴壁后也具有一定的促使分化的作用，所以，培养神经干细胞的皿或瓶用新的无划痕的器皿。
3如果观察到培养过程中出现贴壁细胞，可以通过更换培养瓶的方法来进行挽救，并且发现后越早更换越好。但是如果球体还没有形成，则尽量不要更换器皿和触碰细胞，否则会影响神经球的形成。
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