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菌落PCR（Colony PCR）实验方法
阅读次数：500 发布时间：2020/7/28 11:05:58
菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。*后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。
具体方法：
1、PCR混合物的制备
Taq buffer（10×） 20 ul
dNTP（2.5 mM） 5 ul
Primer Forward（50 mM） 10 ul
Primer Reverse（50 mM） 10 ul
ddH 2O 147 ul
Taq（2U/ul） 8 ul
total 200 ul
将上述溶液混匀，10 ul每管分装于200 ul PCR管中。
2、常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下（管子做好记号，如平板上点的是1＃，则管子上也标1＃，以便筛选到克隆后的扩到培养），盖紧管子。
3、将混有菌体的PCR混合物置于 PCR仪 中，按常规条件扩增。电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。
4、将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜，使菌落扩增；次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，如果早上做PCR的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。
注意事项：设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近*佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。
具体方法：
1、PCR混合物的制备
Taq buffer（10×） 20 ul
dNTP（2.5 mM） 5 ul
Primer Forward（50 mM） 10 ul
Primer Reverse（50 mM） 10 ul
ddH 2O 147 ul
Taq（2U/ul） 8 ul
total 200 ul
将上述溶液混匀，10 ul每管分装于200 ul PCR管中。
2、常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下（管子做好记号，如平板上点的是1＃，则管子上也标1＃，以便筛选到克隆后的扩到培养），盖紧管子。
3、将混有菌体的PCR混合物置于 PCR仪 中，按常规条件扩增。电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。
4、将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜，使菌落扩增；次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，如果早上做PCR的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。
注意事项：设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近*佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。
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