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ELISA实验必看：ELISA试剂盒使用操作要点
阅读次数：430 发布时间：2020/6/1 11:50:24
酶联免疫吸附试验（ELISA） 因其操作简单，灵敏度高，特异性好，经济安全等特点而在临床上广泛应用，但是由于其操作步骤复杂，一般包括试剂准备，样本收集，加样，温育，洗涤，显色，比色，结果判定等，其中任何一项操作不当都会对检测结果产生很大影响。因此，必须加强ELISA检测的全面质量控制，保证其结果的准确可靠。
1 试剂
优质的试剂是保证检验质量的基础。从4℃冰箱取出的试剂必须放置室温20～30 min 后再启用，否则水化层的形成可能影响试剂的原始浓度及试剂中溶质分子的均匀分布。未用完的试剂和质控品应密封并及时放回冰箱保存。根据蛋白质在冷冻过程中出现蛋白分子分布改变的特点，试剂正式启用前应充分混匀。所用蒸馏水、去离子水和自行配制的缓冲液等，都必须调整其pH 值和离子强度等。不同批次的试剂在制作过程中很难保证质量完全一致，因此必须选择和订购长批号的试剂，并保证保存条件，严格执行这一标准可以避免试剂批号改变而重建质控体系及重新评估试剂的复杂过程，并且能够保证结果的稳定性。
2 标本
患者标本中有可能含有干扰试验的免疫物质，导致假阳性或假阴性的结果，干扰因素一般可分为两类，即内源性和外源性干扰因素。内源性干扰因素一般包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异性免疫球蛋白、异嗜性抗体及某些自身抗体等，避免内源性干扰因素主要通过选择合适的试剂；外源性干扰因素包括标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长及标本凝固等。要注意避免标本出现严重溶血，标本中血红蛋白中含有血红素基因，其具有类过氧化物的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（HRP）为标记的ELISA测定试验中，容易在温育过程中吸附于固相，从而与加入的底物反应显色。标本在低温下保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底加深，甚至出现假阳性结果。通常血清标本可在2～8℃保存1 周，冷冻保存时间会更长。血清标本应充分离心，否则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。冷冻保存标本避免反复冻融，标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，使抗体效价下降从而引起假阴性结果。标本的采集及分离要注意尽量避免细菌的污染。此外，标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩分布不均，因此重新溶解的标本必须混匀，但不要剧烈振荡和反复颠倒。
3 操作因素
3.1 加样
加样器是一种比较精密的工具，其在长时间使用时会因机械磨损或推动杆内附着的血痂等原因造成加样不准，因此必须定期对加液器进行维护和校准。每次加不同的标本均需更换吸嘴，以免发生交叉污染；加样速度不可太快，以免将标本加在孔壁上部，并注意不要溅出或产生气泡，加样时还应注意操作时差对结果的影响，尤其对竞争法检测结果影响更大。因此建议在加酶结合物和底物时用多道加液器，或者双人同时加样以减少操作时差对结果的影响，另外有些项目在检测前需要稀释以减少非特异性反应。稀释的方式非常重要，*佳方式是采用振荡器混匀，不可随意改变混匀方式。
3.2 温育
3.2.1温育的温度：育常采用的温度有43 、37℃、室温或4℃等。37℃是实验室中常用的温育温度，也是大多数抗原抗体结合的*适反应温度。抗原抗体反应一般在37℃经1～2 h 产物的生成可达顶峰，为加速反应，可在一定范围内提高反应的温度并在反应过程中连续振荡来增加抗原抗体接触的概率。抗原抗体反应在4℃更为彻底，形成的产物更多、更稳定，但因所需时间太长，在ELISA检测中一般不予采用。
3.2.2温育的方式：温育方式常采用温箱法、微波辐射法和水浴法。其中水浴法能较好解决因受热不均衡所致的周围孔与中央孔结果的吸光度差异（即“边缘效应”）。可将ELISA板置于水浴箱中，板底应贴着水面，使温度迅速平衡，为避免蒸发，可用塑料贴封纸覆盖板孔。若用温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料（如金属等），在盒底垫湿的纱布，*后将ELISA板放在湿纱布上。温育过程中每块反应板不能重叠放置，防止温度扩散的不均匀性。
3.3 洗涤
洗涤是ELISA不同于均相免疫学检测技术的一大特征，洗涤在整个ELISA反应过程中虽不是一个反应步骤，却非常关键。其目的是去除反应体系中与反应无关的成分，包括未结合的酶结合物以及反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗涤液通常为含有一定浓度Tween 20 的缓冲液，Tween 20 是一种非离子去垢剂，既含亲水基团，又含疏水基团，在洗涤中的作用机制是借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白分子的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白分子与固相的吸附。同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促进蛋白质分子脱离固相而进入液相，*终被洗脱。必须注意非离子去垢剂的使用浓度，*常用的洗涤液是含0.05 %Tween20，pH为中性的磷酸盐缓冲液，如果洗涤液中的Tween20 超过0.2% ，可使包被于固相上的抗原抗体解吸附而影响实验的测定下限。洗涤可采用洗板机或手工洗涤两种方式，手工洗板则分为浸泡式和流水冲洗式洗涤。无论洗板方式如何，在向板内注液时应当避免气泡残留孔内，否则会因洗涤液难以进入孔中而影响洗涤效果。在采用洗板机洗板时，要保证洗板机上的每个吸液针都能一致地插入板孔底部将洗液完全吸净，要求洗板后残液小于2 μL，即人工扣板垫纸不湿，浸泡时间超过45 s。
3.4 显色
大多数情况下ELISA商品多选用HRP 和碱性磷酸酶（ALP）。HRP可催化的底物为过氧化氢，参加反应的显色供氢体有邻苯二胺（OPD）、邻联甲苯胺（OT）及四甲基联苯胺（TMB）等。其中OPD 难溶于水，见光易变质，使用前配制，反应过程须避光且OPD有一定毒性。TMB 的反应产物为蓝色，目视对比鲜明，其性质稳定，对人体无毒。若选用各类酸性终止液，则会使蓝色转变为黄色。TMB作底物时的产物检测波长为450 nm ，ALP 作为标记物，其底物一般采用对硝基苯磷酸酯（pNPP），产物为黄色的对硝基酚，吸收波长是405 nm。为了保证结果的稳定性，必须要严格按照试剂盒说明书中规定的温度和时间操作，不可随意改变温度和时间。
3.5 比色
ELISA 显色结果必须通过酶标仪进行检测，不可由肉眼判断结果，因为不同个体的色觉存在差异，尤其是对于乙型肝炎病毒e抗体、乙型肝炎病毒核心抗体这样的检测项目，肉眼难以判断。酶标仪应采用双波长进行测定，包括对颜色产物敏感和不敏感的2个吸收峰波长，用非敏感波长清除由于容器上的划痕、指印、背景等造成的干扰。TMB吸收波长为450 nm ，非敏感波长为630 nm ，一般不设空白孔，否则会出现吸光度值为负值的现象。加入终止液后应尽快比色，否则样本吸光度值会逐渐下降，显色越深下降越快，应在2 min 内比色。
3.6 应加强检测仪器的质量控制
如定量移液器要定期校准；洗板机要及时倾倒废液罐，补充洗涤液，开机后运行冲洗程序（双蒸水），检查系统液路系统（有无漏水），检查吸液和注液速度，关机运行冲洗程序（双蒸水），清洗吸针及水箱，仪器外观清洁；酶标仪要定期检查滤光片是否合格，光源是否稳定，机械系统是否有故障，保持外观清洁，并定期请厂家工程师进行保养维修；水浴箱及存放试剂的冰箱要每天监测温度，并有记录等。
4 结果的判定与报告
4.1 结果的判定
严格依据试剂盒提供的阳性判定值（CO）进行结果判定。厂商提供试剂的同时，说明书上列出的CO值是建立在一系列科学试验及统计研究的基础上，不应随意更改。定量测定需要制备标准曲线，根据标准曲线计算结果。
4.2 灰区的设置
通常情况下ELISA结果报告方式为“阴性”或“阳性”，在二者之间有一条明确的分界线，也就是所谓的阳性判定值即CO值，对于样本的吸光度值（A）高于CO值就判断为阳性，相反则判断为阴性，然而在实际工作中经常会出现样本A 值位于CO 值附近的人群，即ELISA 检测的“灰区”。在国内的传染性病原体抗原和抗体检测的elisa试剂盒中均未涉及到“灰区”的设置，仅仅依靠CO值来决定感染的有无，尤其是对献血员的筛查具有较大风险。笔者在实际工作中发现，结果处于CO值附近的患者重复性很差，也是容易引起医疗纠纷的人群。因此对于检测结果位于“灰区”的患者可采用确认试验或追踪检测方法加以确诊。
4.3 标本的复查
ELISA 手工操作过程复杂，影响因素较多，即使室内质控在控，也可能因孔间差异而造成结果差异，因此制定复查制度及加大复查力度可保证结果的准确性，比如对乙肝“两对半”处于“灰区”的标本及少见模式的检测结果进行复查。本院在实际工作中严格执行复查制度，取得了较好的效果。
5 质量控制
5.1 室内质量控制（IQC）
要保证检验结果的准确可靠，必须做好IQC，首先要保证实验室的环境、仪器设备与硬件设施必须处于良好的状态，其次要对试剂及测定方法过程进行理想化，另外实验室技术人员必须经过良好的培训。ELISA 定性试验的临床意义在于是否检出病原体，与检出量无关。因此质量控制要保证试验的灵敏度，目前国内实验室定性试验的质控规则还没有统一的标准，较多单位采用“即刻法”，结合LeveyJennings 质控图的方法。在每块反应板中除了试剂盒附带的阴阳性对照外，还要选择至少2个室内质控品，其中一个为弱阳性的质控品接近CO值，S/CO值应该为2～4之间，另一个为阴性质控品。认真分析每次IQC失控的原因，定期对各项检测的均值、变异系数等进行比对分析，及时发现试剂盒检出能力的变化，采取适当的措施来提高检测的可靠性。
5.2 室间质量评价（EQA）
EQA 是一种回顾性评价，主要是控制实验室结果的准确性。其要点是保证同一患者的标本一样对待室间质评物，必须强调的是EQA结果必须同IQC一并分析，找出原因，改进工作中的不足，同时指导实验室选择合适的试剂盒。
综上所述，ELISA检测操作步骤复杂，可能会影响测定结果的因素较多，分布在测定操作的各个步骤中，因此必须加强各环节的质量控制，才能得到准确可靠的检测结果。
1 试剂
优质的试剂是保证检验质量的基础。从4℃冰箱取出的试剂必须放置室温20～30 min 后再启用，否则水化层的形成可能影响试剂的原始浓度及试剂中溶质分子的均匀分布。未用完的试剂和质控品应密封并及时放回冰箱保存。根据蛋白质在冷冻过程中出现蛋白分子分布改变的特点，试剂正式启用前应充分混匀。所用蒸馏水、去离子水和自行配制的缓冲液等，都必须调整其pH 值和离子强度等。不同批次的试剂在制作过程中很难保证质量完全一致，因此必须选择和订购长批号的试剂，并保证保存条件，严格执行这一标准可以避免试剂批号改变而重建质控体系及重新评估试剂的复杂过程，并且能够保证结果的稳定性。
2 标本
患者标本中有可能含有干扰试验的免疫物质，导致假阳性或假阴性的结果，干扰因素一般可分为两类，即内源性和外源性干扰因素。内源性干扰因素一般包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异性免疫球蛋白、异嗜性抗体及某些自身抗体等，避免内源性干扰因素主要通过选择合适的试剂；外源性干扰因素包括标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长及标本凝固等。要注意避免标本出现严重溶血，标本中血红蛋白中含有血红素基因，其具有类过氧化物的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（HRP）为标记的ELISA测定试验中，容易在温育过程中吸附于固相，从而与加入的底物反应显色。标本在低温下保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底加深，甚至出现假阳性结果。通常血清标本可在2～8℃保存1 周，冷冻保存时间会更长。血清标本应充分离心，否则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。冷冻保存标本避免反复冻融，标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，使抗体效价下降从而引起假阴性结果。标本的采集及分离要注意尽量避免细菌的污染。此外，标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩分布不均，因此重新溶解的标本必须混匀，但不要剧烈振荡和反复颠倒。
3 操作因素
3.1 加样
加样器是一种比较精密的工具，其在长时间使用时会因机械磨损或推动杆内附着的血痂等原因造成加样不准，因此必须定期对加液器进行维护和校准。每次加不同的标本均需更换吸嘴，以免发生交叉污染；加样速度不可太快，以免将标本加在孔壁上部，并注意不要溅出或产生气泡，加样时还应注意操作时差对结果的影响，尤其对竞争法检测结果影响更大。因此建议在加酶结合物和底物时用多道加液器，或者双人同时加样以减少操作时差对结果的影响，另外有些项目在检测前需要稀释以减少非特异性反应。稀释的方式非常重要，*佳方式是采用振荡器混匀，不可随意改变混匀方式。
3.2 温育
3.2.1温育的温度：育常采用的温度有43 、37℃、室温或4℃等。37℃是实验室中常用的温育温度，也是大多数抗原抗体结合的*适反应温度。抗原抗体反应一般在37℃经1～2 h 产物的生成可达顶峰，为加速反应，可在一定范围内提高反应的温度并在反应过程中连续振荡来增加抗原抗体接触的概率。抗原抗体反应在4℃更为彻底，形成的产物更多、更稳定，但因所需时间太长，在ELISA检测中一般不予采用。
3.2.2温育的方式：温育方式常采用温箱法、微波辐射法和水浴法。其中水浴法能较好解决因受热不均衡所致的周围孔与中央孔结果的吸光度差异（即“边缘效应”）。可将ELISA板置于水浴箱中，板底应贴着水面，使温度迅速平衡，为避免蒸发，可用塑料贴封纸覆盖板孔。若用温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料（如金属等），在盒底垫湿的纱布，*后将ELISA板放在湿纱布上。温育过程中每块反应板不能重叠放置，防止温度扩散的不均匀性。
3.3 洗涤
洗涤是ELISA不同于均相免疫学检测技术的一大特征，洗涤在整个ELISA反应过程中虽不是一个反应步骤，却非常关键。其目的是去除反应体系中与反应无关的成分，包括未结合的酶结合物以及反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗涤液通常为含有一定浓度Tween 20 的缓冲液，Tween 20 是一种非离子去垢剂，既含亲水基团，又含疏水基团，在洗涤中的作用机制是借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白分子的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白分子与固相的吸附。同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促进蛋白质分子脱离固相而进入液相，*终被洗脱。必须注意非离子去垢剂的使用浓度，*常用的洗涤液是含0.05 %Tween20，pH为中性的磷酸盐缓冲液，如果洗涤液中的Tween20 超过0.2% ，可使包被于固相上的抗原抗体解吸附而影响实验的测定下限。洗涤可采用洗板机或手工洗涤两种方式，手工洗板则分为浸泡式和流水冲洗式洗涤。无论洗板方式如何，在向板内注液时应当避免气泡残留孔内，否则会因洗涤液难以进入孔中而影响洗涤效果。在采用洗板机洗板时，要保证洗板机上的每个吸液针都能一致地插入板孔底部将洗液完全吸净，要求洗板后残液小于2 μL，即人工扣板垫纸不湿，浸泡时间超过45 s。
3.4 显色
大多数情况下ELISA商品多选用HRP 和碱性磷酸酶（ALP）。HRP可催化的底物为过氧化氢，参加反应的显色供氢体有邻苯二胺（OPD）、邻联甲苯胺（OT）及四甲基联苯胺（TMB）等。其中OPD 难溶于水，见光易变质，使用前配制，反应过程须避光且OPD有一定毒性。TMB 的反应产物为蓝色，目视对比鲜明，其性质稳定，对人体无毒。若选用各类酸性终止液，则会使蓝色转变为黄色。TMB作底物时的产物检测波长为450 nm ，ALP 作为标记物，其底物一般采用对硝基苯磷酸酯（pNPP），产物为黄色的对硝基酚，吸收波长是405 nm。为了保证结果的稳定性，必须要严格按照试剂盒说明书中规定的温度和时间操作，不可随意改变温度和时间。
3.5 比色
ELISA 显色结果必须通过酶标仪进行检测，不可由肉眼判断结果，因为不同个体的色觉存在差异，尤其是对于乙型肝炎病毒e抗体、乙型肝炎病毒核心抗体这样的检测项目，肉眼难以判断。酶标仪应采用双波长进行测定，包括对颜色产物敏感和不敏感的2个吸收峰波长，用非敏感波长清除由于容器上的划痕、指印、背景等造成的干扰。TMB吸收波长为450 nm ，非敏感波长为630 nm ，一般不设空白孔，否则会出现吸光度值为负值的现象。加入终止液后应尽快比色，否则样本吸光度值会逐渐下降，显色越深下降越快，应在2 min 内比色。
3.6 应加强检测仪器的质量控制
如定量移液器要定期校准；洗板机要及时倾倒废液罐，补充洗涤液，开机后运行冲洗程序（双蒸水），检查系统液路系统（有无漏水），检查吸液和注液速度，关机运行冲洗程序（双蒸水），清洗吸针及水箱，仪器外观清洁；酶标仪要定期检查滤光片是否合格，光源是否稳定，机械系统是否有故障，保持外观清洁，并定期请厂家工程师进行保养维修；水浴箱及存放试剂的冰箱要每天监测温度，并有记录等。
4 结果的判定与报告
4.1 结果的判定
严格依据试剂盒提供的阳性判定值（CO）进行结果判定。厂商提供试剂的同时，说明书上列出的CO值是建立在一系列科学试验及统计研究的基础上，不应随意更改。定量测定需要制备标准曲线，根据标准曲线计算结果。
4.2 灰区的设置
通常情况下ELISA结果报告方式为“阴性”或“阳性”，在二者之间有一条明确的分界线，也就是所谓的阳性判定值即CO值，对于样本的吸光度值（A）高于CO值就判断为阳性，相反则判断为阴性，然而在实际工作中经常会出现样本A 值位于CO 值附近的人群，即ELISA 检测的“灰区”。在国内的传染性病原体抗原和抗体检测的elisa试剂盒中均未涉及到“灰区”的设置，仅仅依靠CO值来决定感染的有无，尤其是对献血员的筛查具有较大风险。笔者在实际工作中发现，结果处于CO值附近的患者重复性很差，也是容易引起医疗纠纷的人群。因此对于检测结果位于“灰区”的患者可采用确认试验或追踪检测方法加以确诊。
4.3 标本的复查
ELISA 手工操作过程复杂，影响因素较多，即使室内质控在控，也可能因孔间差异而造成结果差异，因此制定复查制度及加大复查力度可保证结果的准确性，比如对乙肝“两对半”处于“灰区”的标本及少见模式的检测结果进行复查。本院在实际工作中严格执行复查制度，取得了较好的效果。
5 质量控制
5.1 室内质量控制（IQC）
要保证检验结果的准确可靠，必须做好IQC，首先要保证实验室的环境、仪器设备与硬件设施必须处于良好的状态，其次要对试剂及测定方法过程进行理想化，另外实验室技术人员必须经过良好的培训。ELISA 定性试验的临床意义在于是否检出病原体，与检出量无关。因此质量控制要保证试验的灵敏度，目前国内实验室定性试验的质控规则还没有统一的标准，较多单位采用“即刻法”，结合LeveyJennings 质控图的方法。在每块反应板中除了试剂盒附带的阴阳性对照外，还要选择至少2个室内质控品，其中一个为弱阳性的质控品接近CO值，S/CO值应该为2～4之间，另一个为阴性质控品。认真分析每次IQC失控的原因，定期对各项检测的均值、变异系数等进行比对分析，及时发现试剂盒检出能力的变化，采取适当的措施来提高检测的可靠性。
5.2 室间质量评价（EQA）
EQA 是一种回顾性评价，主要是控制实验室结果的准确性。其要点是保证同一患者的标本一样对待室间质评物，必须强调的是EQA结果必须同IQC一并分析，找出原因，改进工作中的不足，同时指导实验室选择合适的试剂盒。
综上所述，ELISA检测操作步骤复杂，可能会影响测定结果的因素较多，分布在测定操作的各个步骤中，因此必须加强各环节的质量控制，才能得到准确可靠的检测结果。
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