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岑特生物提供基因合成定制服务!!!
阅读次数：434 发布时间：2020/5/21 13:18:07
客户提供
基因序列或蛋白质氨基酸序列
*终交付
约4 μg含有目的片段的高纯度冻干质粒DNA；
含有重组质粒的穿刺菌一管（0）；
发货文件主要包括如下内容：测序结果、COA报告、sqd文件。
备注：默认合成克隆基因至pUC57载体
郑重承诺：对客户提供的核酸/氨基酸序列或基因合成的结果没有所有权，并承诺对结果严格保密，且不会以任何形式散布到第三方。
载体选择主要考虑下述3点：
1、构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
2、载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力—据克隆片段大小（大选大，小选小）。尤其对于病毒载体来说，载体包装容量的大小是评估能否成功包装病毒的首要因素。
①腺病毒可以插入长约8kb的外源基因。目前，我们包装过长度为7.5kb外源基因的腺病毒。
②慢病毒的包装容量约为6kb（包含载体带有的其他抗性基因或报告基因），但是2kb以上的外源基因包装慢病毒难度就增加了，增大1kb会下降1个单位数量级的滴度，故2kb以上的基因包装慢病毒需要进行评估。此外，毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白（作为受体、转运蛋白行使功能）等由于其本身的功能，包装可能会有一定难度。
③AAV的总包装容量是4.7 kb（包含载体中两个ITR约0.3kb +具体启动子 + 内含子约0.6kb + 具体荧光标签 + polyA约0.2kb），所以插入目的基因一般约2kb 左右。由于AAV包装容量有限，目的基因大于2kb，可考虑去除内含子，因为内含子只是有助于插入的目的基因稳定表达。
（2）确定表达蛋白的目的，然后再来选择优势的表达质粒。一般分为原核表达和真核表达质粒，前者主要用于体外纯化蛋白，如带His-tag的PET系列，带GST-Tag的PGEX系列，选用不同的表达载体，就得建立相应的纯化系统，包括缓冲液的配置、珠子/柱子的选择等等，还得考虑目的蛋白的可溶性，一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些，如GST的。这种原核纯化的蛋白一般用来制备单一的、需要量大的蛋白。真核表达载体一般是细胞、体内表达等需要时所用，只需要将它放到细胞或体内细胞即可，考虑的是它的启动子的选择，常用都是cmv启动子的，表达效率较高，也有多种启动子经过改造的表达载体，一般用来表达需要调控表达时间及表达量的蛋白。
3、载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于连接，不产生阅读框架错位。
①选分子量小的质粒，即小载体（1-1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；
②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个；
③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；
④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因。
基因序列或蛋白质氨基酸序列
*终交付
约4 μg含有目的片段的高纯度冻干质粒DNA；
含有重组质粒的穿刺菌一管（0）；
发货文件主要包括如下内容：测序结果、COA报告、sqd文件。
备注：默认合成克隆基因至pUC57载体
郑重承诺：对客户提供的核酸/氨基酸序列或基因合成的结果没有所有权，并承诺对结果严格保密，且不会以任何形式散布到第三方。
载体选择主要考虑下述3点：
1、构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
2、载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力—据克隆片段大小（大选大，小选小）。尤其对于病毒载体来说，载体包装容量的大小是评估能否成功包装病毒的首要因素。
①腺病毒可以插入长约8kb的外源基因。目前，我们包装过长度为7.5kb外源基因的腺病毒。
②慢病毒的包装容量约为6kb（包含载体带有的其他抗性基因或报告基因），但是2kb以上的外源基因包装慢病毒难度就增加了，增大1kb会下降1个单位数量级的滴度，故2kb以上的基因包装慢病毒需要进行评估。此外，毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白（作为受体、转运蛋白行使功能）等由于其本身的功能，包装可能会有一定难度。
③AAV的总包装容量是4.7 kb（包含载体中两个ITR约0.3kb +具体启动子 + 内含子约0.6kb + 具体荧光标签 + polyA约0.2kb），所以插入目的基因一般约2kb 左右。由于AAV包装容量有限，目的基因大于2kb，可考虑去除内含子，因为内含子只是有助于插入的目的基因稳定表达。
（2）确定表达蛋白的目的，然后再来选择优势的表达质粒。一般分为原核表达和真核表达质粒，前者主要用于体外纯化蛋白，如带His-tag的PET系列，带GST-Tag的PGEX系列，选用不同的表达载体，就得建立相应的纯化系统，包括缓冲液的配置、珠子/柱子的选择等等，还得考虑目的蛋白的可溶性，一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些，如GST的。这种原核纯化的蛋白一般用来制备单一的、需要量大的蛋白。真核表达载体一般是细胞、体内表达等需要时所用，只需要将它放到细胞或体内细胞即可，考虑的是它的启动子的选择，常用都是cmv启动子的，表达效率较高，也有多种启动子经过改造的表达载体，一般用来表达需要调控表达时间及表达量的蛋白。
3、载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于连接，不产生阅读框架错位。
①选分子量小的质粒，即小载体（1-1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；
②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个；
③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；
④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因。
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