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你难道还在用质粒做 CRISPR 基因编辑？岑特新闻√
阅读次数：592 发布时间：2019/12/5 9:32:38
CRISPR-Cas9 为基因工程领域打开了一扇崭新的大门。这个相对简单的分子生物学工具几乎可以用来编辑任何基因组。CRISPR-Cas9 复合物由可编码的 guide RNA (gRNA) 和 Cas9 核酸酶组成，这两种成分结合形成核糖核蛋白复合物（RNP），然后结合并切割目标基因，再进一步利用细胞的修复机制来实现基因组的编辑。
在过去的几年里，CRISPR-Cas9 技术已经被越来越多的研究人员所采用，并且在包括医学、农业和疾病控制等许多领域产生了重大影响。
在设计 CRISPR 实验时，gRNA 和 Cas9 的结构是一个需要考虑的重要因素。在瞬时转染的时候 (即成分短暂存在于细胞内)，gRNA 和 Cas9 可以用质粒 DNA、RNA 或预先复合的 RNPs 传递。目前有许多研究人员倾向于选择质粒，因为它们便宜、易于使用，而且可以加入标记基因。然而，用质粒表达 gRNA 和 Cas9 也存在一些问题。
在这篇文章中，我们将概述其中的一些缺陷，并指出为什么使用 RNPs 是更好的选择的。
CRISPR 质粒转染会增加脱靶效应
在任何 CRISPR 实验中，*令人关注的方面就是在错误的位置切割基因组 DNA，即脱靶效应。虽然精心设计的 gRNA 会在大多数情况下结合在正确的 DNA 位点，但是它们也可能会与只有少数错配的序列结合。这些脱靶效应会造成严重问题，因为被错误编辑的基因位点可能会改变表型，或是对目标细胞与有机体产生有害影响。
CRISPR 组成以质粒形式导入常常与高水平的脱靶效应相关。这种效应是由于质粒在细胞内停留的时间相对较长，可能会持续数周。期间 gRNA 和 Cas9 会大量表达，因此有更大可能性使得 gRNA-Cas9 切割错误的位点。
几项研究表明，当 CRISPR 组成成分以预先复合的 RNPs 而非质粒 DNA 的形式传递时 (Liang et al. 2015, Kim et al. 2014) ，脱靶突变的频率较低。例如，Liang 等人 (2015) 发现，对于 OT3-18 基因，与质粒 DNA 相比，当使用 RNPs 时，脱靶突变与目标突变的比率降低了 28 倍。RNPs 较低的脱靶率可能与其在细胞内活性维持时间较短相关。与质粒不同的是，RNPs 在转染后能迅速切割基因组 DNA，并且在细胞中只停留一天左右就被降解了 (Kim 等人 2014)。由于切割基因组 DNA 的时间更短，所以脱靶效应也减少了。
质粒 DNA 可能会整合到宿主基因组上
质粒转染的另一个潜在问题是质粒 DNA 的全部或部分序列可能会随机整合到目标细胞的基因组中。Kim 等人 (2014) 发现，质粒导致的插入普遍存在于目标和非目标位点。虽然可以通过测序检测目标位点是否存在插入片段，但确定非目标位点的插入就变得困难许多，因此应当使用 RNPs 转染来避免外源 DNA 整合进基因组。
RNPs 对细胞的毒性比 CRISPR 质粒小
DNA 转染通常会给细胞带来生存压力，外源 DNA 的存在可能触发人原代细胞和多能干细胞中环化 GMP-AMP 合成酶的激活。对于这种敏感的细胞类型，使用 RNP 而不是质粒转染可以降低对细胞的毒性。根据 Kim 等人 (2014) 的研究，与质粒转染相比，RNPs 转染至少可以产生 2 倍以上的有活性的胚胎干细胞集落。
质粒表现出多变的 CRISPR 编辑效率
质粒可能存在质量问题。当 CRISPR 组分以质粒 DNA 的形式转染时，在进行任何基因编辑之前，需要在细胞内进行 gRNA 和 Cas9 转录与 Cas9 翻译。这不仅延长了实验时间，而且 gRNA 的表达或者 Cas9 的组装和折叠有出错的风险。使用 RNPs 则可以避免这些问题，因为 gRNA 和蛋白质成分是在转染之前制备的，而且 gRNA 和 Cas9 的质量可以在它们被导入细胞之前得到验证。
RNP 的另一个好处是使得 gRNA 受到 Cas9 的保护，从而降低 gRNA 降解的风险。此外，合成的 gRNA 可以进行化学修饰，以防止核酸内切酶降解和免疫攻击。这两种因素都能使 gRNA 在短时间内更有效地靶向基因组 DNA (Hendel & Bak 等人 2015)。
考虑到 RNPs 的诸多优势，它们在多种永生细胞、原代细胞和干细胞中都能一直保持高编辑效率也就不足为奇了，(e.g., Hendel & Bak 等 2015, Kim 等 2014, Liang 等 2015, Lin 等 2014). 此外，我们都知道通过同源定向修复机制实现基因敲入是一个效率极低的过程，但通过使用 RNPs 我们可以提升这一过程的效率。(Gaj 等 2017, Lin 等 2014, Schumann 等 2015).
用 RNPs 代替质粒来做 CRISPR 值得吗？
当尝试用 RNPs 替换质粒时，你可能仍然在想质粒的一些优点，比如，它们很便宜。但问问你自己，这些所谓的优点真的值得你在你的细胞中引入更多的脱靶编辑吗? 或者甚至是将外源 DNA 整合进你的细胞赖以生存的必需基因中? 有些人或许会认为，质粒中可以加入标记基因 (如抗生素基因) 是一种无法比拟的优势，因为它能使你富集被转染的细胞。然而，由于使用 RNPs 通常会让你的编辑效率超过 70%，所以向质粒中加入标记基因变得完全不必要了。考虑到这些因素，你应该明白 RNPs 的好处已经远远超过其成本了。从今天起，让 RNPs 成为你得心应手的 CRISPR 工具吧！
参考文献
Gaj T. et al. 2017. Targeted gene knock-in by homology-directed genome editing using Cas9 ribonucleoprotein ａnd AAV donor delivery. Nucleic Acids Research 45(11):e98.
Hendel A ａnd Bak RO et al. 2015. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nature Biotechnology 33:985–989.
Kim S et al. 2014. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research 24:1012–1019.
Liang X et al. 2015. Rapid ａnd highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology 208: 44–53.
Lin S et al. 2014. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, e04766-e04766.
Schumann K et al. 2015. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442.
在过去的几年里，CRISPR-Cas9 技术已经被越来越多的研究人员所采用，并且在包括医学、农业和疾病控制等许多领域产生了重大影响。
在设计 CRISPR 实验时，gRNA 和 Cas9 的结构是一个需要考虑的重要因素。在瞬时转染的时候 (即成分短暂存在于细胞内)，gRNA 和 Cas9 可以用质粒 DNA、RNA 或预先复合的 RNPs 传递。目前有许多研究人员倾向于选择质粒，因为它们便宜、易于使用，而且可以加入标记基因。然而，用质粒表达 gRNA 和 Cas9 也存在一些问题。
在这篇文章中，我们将概述其中的一些缺陷，并指出为什么使用 RNPs 是更好的选择的。
CRISPR 质粒转染会增加脱靶效应
在任何 CRISPR 实验中，*令人关注的方面就是在错误的位置切割基因组 DNA，即脱靶效应。虽然精心设计的 gRNA 会在大多数情况下结合在正确的 DNA 位点，但是它们也可能会与只有少数错配的序列结合。这些脱靶效应会造成严重问题，因为被错误编辑的基因位点可能会改变表型，或是对目标细胞与有机体产生有害影响。
CRISPR 组成以质粒形式导入常常与高水平的脱靶效应相关。这种效应是由于质粒在细胞内停留的时间相对较长，可能会持续数周。期间 gRNA 和 Cas9 会大量表达，因此有更大可能性使得 gRNA-Cas9 切割错误的位点。
几项研究表明，当 CRISPR 组成成分以预先复合的 RNPs 而非质粒 DNA 的形式传递时 (Liang et al. 2015, Kim et al. 2014) ，脱靶突变的频率较低。例如，Liang 等人 (2015) 发现，对于 OT3-18 基因，与质粒 DNA 相比，当使用 RNPs 时，脱靶突变与目标突变的比率降低了 28 倍。RNPs 较低的脱靶率可能与其在细胞内活性维持时间较短相关。与质粒不同的是，RNPs 在转染后能迅速切割基因组 DNA，并且在细胞中只停留一天左右就被降解了 (Kim 等人 2014)。由于切割基因组 DNA 的时间更短，所以脱靶效应也减少了。
质粒 DNA 可能会整合到宿主基因组上
质粒转染的另一个潜在问题是质粒 DNA 的全部或部分序列可能会随机整合到目标细胞的基因组中。Kim 等人 (2014) 发现，质粒导致的插入普遍存在于目标和非目标位点。虽然可以通过测序检测目标位点是否存在插入片段，但确定非目标位点的插入就变得困难许多，因此应当使用 RNPs 转染来避免外源 DNA 整合进基因组。
RNPs 对细胞的毒性比 CRISPR 质粒小
DNA 转染通常会给细胞带来生存压力，外源 DNA 的存在可能触发人原代细胞和多能干细胞中环化 GMP-AMP 合成酶的激活。对于这种敏感的细胞类型，使用 RNP 而不是质粒转染可以降低对细胞的毒性。根据 Kim 等人 (2014) 的研究，与质粒转染相比，RNPs 转染至少可以产生 2 倍以上的有活性的胚胎干细胞集落。
质粒表现出多变的 CRISPR 编辑效率
质粒可能存在质量问题。当 CRISPR 组分以质粒 DNA 的形式转染时，在进行任何基因编辑之前，需要在细胞内进行 gRNA 和 Cas9 转录与 Cas9 翻译。这不仅延长了实验时间，而且 gRNA 的表达或者 Cas9 的组装和折叠有出错的风险。使用 RNPs 则可以避免这些问题，因为 gRNA 和蛋白质成分是在转染之前制备的，而且 gRNA 和 Cas9 的质量可以在它们被导入细胞之前得到验证。
RNP 的另一个好处是使得 gRNA 受到 Cas9 的保护，从而降低 gRNA 降解的风险。此外，合成的 gRNA 可以进行化学修饰，以防止核酸内切酶降解和免疫攻击。这两种因素都能使 gRNA 在短时间内更有效地靶向基因组 DNA (Hendel & Bak 等人 2015)。
考虑到 RNPs 的诸多优势，它们在多种永生细胞、原代细胞和干细胞中都能一直保持高编辑效率也就不足为奇了，(e.g., Hendel & Bak 等 2015, Kim 等 2014, Liang 等 2015, Lin 等 2014). 此外，我们都知道通过同源定向修复机制实现基因敲入是一个效率极低的过程，但通过使用 RNPs 我们可以提升这一过程的效率。(Gaj 等 2017, Lin 等 2014, Schumann 等 2015).
用 RNPs 代替质粒来做 CRISPR 值得吗？
当尝试用 RNPs 替换质粒时，你可能仍然在想质粒的一些优点，比如，它们很便宜。但问问你自己，这些所谓的优点真的值得你在你的细胞中引入更多的脱靶编辑吗? 或者甚至是将外源 DNA 整合进你的细胞赖以生存的必需基因中? 有些人或许会认为，质粒中可以加入标记基因 (如抗生素基因) 是一种无法比拟的优势，因为它能使你富集被转染的细胞。然而，由于使用 RNPs 通常会让你的编辑效率超过 70%，所以向质粒中加入标记基因变得完全不必要了。考虑到这些因素，你应该明白 RNPs 的好处已经远远超过其成本了。从今天起，让 RNPs 成为你得心应手的 CRISPR 工具吧！
参考文献
Gaj T. et al. 2017. Targeted gene knock-in by homology-directed genome editing using Cas9 ribonucleoprotein ａnd AAV donor delivery. Nucleic Acids Research 45(11):e98.
Hendel A ａnd Bak RO et al. 2015. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nature Biotechnology 33:985–989.
Kim S et al. 2014. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research 24:1012–1019.
Liang X et al. 2015. Rapid ａnd highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology 208: 44–53.
Lin S et al. 2014. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, e04766-e04766.
Schumann K et al. 2015. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442.
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