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细胞凋亡WB没成功，你是不是用了RIPA？
阅读次数：1967 发布时间：2018/8/27 15:58:17
细胞凋亡是一种在基因控制下的细胞主动死亡过程，通常表现为核浓缩，起皱，膜发泡以及 DNA 片段化。WB 是研究细胞凋亡机理的基本方法，但是 WB 也不是谁都能做成功的，因为有可能你的步就做错了！用 WB 做细胞凋亡研究样品制备是步，样品制备方法至关重要否则会得到错误的结果和结论。
样品制备，看你是不是这样做的：
自配裂解液或者购买 RIPA，加上样品研磨啊研磨，孵育啊孵育，然后离心扔掉沉淀（RIPA 不可溶组分），取上清（RIPA 可溶组分）进行下游实验。
对对对！都是这么做啊，扔了取上清！
且慢，我们扔掉了，扔掉了，扔掉了一些啥？要不要紧，影响细胞凋亡的实验结果不？
例一． Zapata et al., （1998）. Granzyme Release ａnd Caspase Activation in Activated Human T-Lymphocytes. J Biol Chem 1998, 273:6916-6920.
Caspase 家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中 caspase-3 为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的 Caspase-3 由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，*终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase 的活性明显下降。
研究方法：
1.分别使用 RIPA 和 2%SDS + 超声提取未激活 T 淋巴细胞（Lanes 1 和 5）和激活的 T 淋巴细胞（Lanes 2-4 和 6-8）裂解细胞提取总蛋白
2.WB 进行 caspase-3, caspase-7, parp ａnd GD1 检测
主要发现：
p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中，但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中却不存在。证明了 RIPA buffer 提取蛋白时会人工激活 caspase-3 ａnd caspase-7。用 Laemmli 缓冲液加超声处理可进一步从 RIPA 不可溶性组分中提取出蛋白。
样品制备，看你是不是这样做的：
自配裂解液或者购买 RIPA，加上样品研磨啊研磨，孵育啊孵育，然后离心扔掉沉淀（RIPA 不可溶组分），取上清（RIPA 可溶组分）进行下游实验。
对对对！都是这么做啊，扔了取上清！
且慢，我们扔掉了，扔掉了，扔掉了一些啥？要不要紧，影响细胞凋亡的实验结果不？
例一． Zapata et al., （1998）. Granzyme Release ａnd Caspase Activation in Activated Human T-Lymphocytes. J Biol Chem 1998, 273:6916-6920.
Caspase 家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中 caspase-3 为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的 Caspase-3 由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，*终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase 的活性明显下降。
研究方法：
1.分别使用 RIPA 和 2%SDS + 超声提取未激活 T 淋巴细胞（Lanes 1 和 5）和激活的 T 淋巴细胞（Lanes 2-4 和 6-8）裂解细胞提取总蛋白
2.WB 进行 caspase-3, caspase-7, parp ａnd GD1 检测
主要发现：
p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中，但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中却不存在。证明了 RIPA buffer 提取蛋白时会人工激活 caspase-3 ａnd caspase-7。用 Laemmli 缓冲液加超声处理可进一步从 RIPA 不可溶性组分中提取出蛋白。
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