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技术文章/ARTICLE

岑特实验：菌体浓度测定方法/细菌计数方法

点击次数：385 发布时间：2022/6/7 13:18:05

菌体浓度是指单位体积培养液中菌体的含量。常用的菌体浓度的测定方法（细菌计数方法）主要有以下几种：

1. 直接计数法
这是一种非常简单的检测方法，我们可以利用计数板或计数仪直接得出细菌数目。

1.1细菌计数板
先制备细菌悬液，取一定体积的样品细菌悬液置于细菌计数板的计数池内，用显微镜观察计数。根据计数室刻度内的细菌数，计算样品中的含菌数。
特点：所需设备简单，测定结果较准确，可迅速得到结果，而且在计数的同时能观察到所研究微生物的形态特征。不能区分是否为细菌，不能区分活细菌和死细菌。
单位：个/mL

计算方法：
（1）25×16的计数板：
每毫升细菌数量=（100小格内的细胞数/100）×400×1000×稀释倍数

（2）16×25的计数板：
每毫升细菌数量=（80小格内的细胞数/80）×400×1000×稀释倍数

1.2 电子计数器计数法
电子计数器也属于直接计数法，其工作原理类似于血细胞分析仪，测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细菌，当一个细菌通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。
计数单位：个/mL
特点：该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。

2. 活菌计数法
常用的有平板菌落计数法（cfu法），其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。取一定容量的细菌悬液，制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每mL原始样品中所含活细菌的总数。
特点：此法灵敏度高，是临床微生物检验工作中常用的活菌计数法。两种方法会将活与死的细菌全部算入，但是此方法只计算活的细菌。

计数单位：cfu/mL（cfu是菌落形成单位，是指由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，是计算细菌或霉菌数量的单位。cfu/mL指的是每毫升样品中含有的细菌菌落总数。菌落形成单位的计数方式与两种计数方式不同，两种方法会将活与死的细菌全部算入，但是该方法计算活的细菌）。

3. 比浊法
比浊法又称浊度测定法。为测量透过悬浮质点介质的光强度来确定悬浮物质浓度的方法，这是一种光散射测量技术。常用的方法有：

3.1 麦氏比浊法
McFarland发明了一种用于微生物比浊的不同浊度的标准浊度管，具体的配制方法是根据硫酸和氯化钡的比例来定的

0.5ml氯化钡（1.17%）加入99.5ml硫酸(1%），所得溶液浊度即为0.5麦氏单位。0.5麦氏浓度菌液是临床微生物药敏实验常用浓度，通常认为，如将配菌液浓度配成0.5麦氏比浊管时，相当于1.5×108细菌数/mL）。

麦氏比浊管可以自己配制，也可购买商品化标准麦氏比浊管，将制备的菌悬液与标准麦氏比浊管比较，与多少麦氏浊度的浊度相同即为多少麦氏浓度的菌液。

特点：该方法实际上为目视比浊法，使用肉眼观察浊度，误差较大。
单位：mcf（即麦氏浊度单位）。

3.2麦氏比浊仪
是一种采用麦氏比浊法的自动化分析仪器，以其灵敏、准确、快捷的优点逐渐取代人工法成为细菌浊度测定的主要工具。麦氏比浊仪测量细菌溶液样品并直接显示麦氏单位浊度值，根据通用麦氏单位浊度值与细菌数的关系即可换算出细菌浓度。

特点：简单快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。
单位：mcf（即麦氏浊度单位）。

3.3光电比浊法
当光束通过悬浊液时, 由于被散射或吸收而降低其透过量，细菌悬浊液的浓度在一定范围内与光密度成正比，与透光度成反比，这就是光电比浊法的依据。常用的有分光光度计法。

特点：此方法简单快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样本，不能用此方法。
单位：OD值（光密度）。

4. 测定重量法
此法分为是干重法和湿重法。此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。

特点：此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的常用方法。
单位：mg/mL

5、测定细胞总氮量或总碳量
氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。
特点：此法适于细胞浓度较高的样品。

6、颜色改变单位法（colour change unit,简称CCU）
ccu是颜色改变单位，以微生物在培养基中的代谢活力为指标，根据培养基颜色的改变来计数微生物数量的单位。

以解脲脲原体为例：
1、取12只无菌试管，每一管装1.8mL解脲脲原体培养基。
2、在管加入0.2mL待测解脲脲原体菌液，充分混匀，从中吸取0.2mL加入第二管，依次类推，10倍梯度稀释，一直到末一管。
3、37℃培养，以培养基颜色改变的末一管作为待测菌液的CCU，也就是支原体的大代谢活力，比如第六管出现颜色改变，他的相对浓度就是10的6次方CCU/mL，即106CCU/mL。

特点：这种方法通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物，比如支原体等，因为支原体的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透明红色，因此无法用比浊法来计数；而由于支原体固体培养很困难，用cfu法也不容易计数，所以需要用特殊的计数方法，即CCU法。
单位：ccu/mL

原创作者：上海岑特生物科技有限公司