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关于生化试剂应用常见问题的探讨
点击次数：27 发布时间：2024/9/23 9:22:40
试剂空白吸光度是反映试剂质量的指标，但不能反映试剂质量的全部。试剂成份、纯度、用量及稳定性，才是保/证试剂质量的关键所在。目市售的一些试剂具有抗干扰作用，主要是通过加入抗干扰物质或使用新的色素原以避免内源性物质的干扰。但值得注意的是：一些试验项目在消除内源性物质干扰的同时，会带来样品含量真实性的变化。
1 试剂空白
试剂空白吸光度是反映试剂质量的指标。每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示该试剂的变质；如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因含酚类物质被氧化为醌而变为红色。碱性磷酸酶、r一谷氨酰转肽酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或酚基苯胺而变黄。有些试剂久置后变浑浊。这些情况均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应，在放置过程中其试剂空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降。原则上，吸光度上升的反应，其试剂空白吸光度越低越好，不能超过一个高限；相反，吸光度下降的反应，其试剂空白吸光度不能低于一个低限。因此，试剂空白吸光度限值，常作为程序参数输入仪器，如经核查超限，仪器会自动报警，提示更换试剂。需要指出的是，还原型辅酶I(或II)等投料量不足或劣质的原料，往往需要加大用量，才使“表观”吸光度上升，凑合过试剂空白核对的“关”，其后果为如下情况：
1．1 线性范围变窄 现象：高值测不高。原因：生产试剂时有效成分投料量不足；试剂成份稳定性较差。
1．2 灵敏度变低现象：酶促反应速度曲线斜率下降，测定结果有严重系统误差。原因：试剂底物浓度不足。
1．3 低值偏高 现象：试剂空白的变化曲线(吸光度VS时间)明显波动。原因：试剂自身不稳定，自行分解；工具酶纯度
不够，杂酶含量超限，导致干扰作用。
2 样品信息
样品的溶血、脂血、黄疸等会对测定结果产生非化学反应的干扰。因此，应根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，采用双波长或多波长的检测模式，并在结果计算中扣除因溶血、脂血、黄疸引起的影响，减少干扰程度。
3 测定范围
每种待测物都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超过此范围，分析仪将显示结果超过范围的提示。表示试剂已经变质，应更换合格试剂。
4 底物耗尽
使用连续监测法、两点法测定酶活性时，若酶活性非常高，底物接近被耗尽，吸光度上升或下降会超过某一吸光度变化范围，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。
5 酶的预活化
测定血清中的某些酶，如CK，离体(采血)后很容易失活。失活的原因是酶活性中心的活性基因巯基(一SH)被氧化造成的。只有通过适当的还原作用才能重新激活。如CK—NAC试剂盒即含有CK活化剂，名为N一乙酰半胱氨酸。实验研究证明，NAC对血清中已失活的CK活化过程约需180 S。这就是CK测定为什么要延迟时间较长的理论依据。在AST，ALT采用IFCC推荐方法测定时需要磷酸吡哆醛预活化。需要强调：含有活化剂的生化试剂，其测定酶活性的结果要高些。
6 校准与结果溯源性
酶的校正：要满足在同一方法学、同一测定条件、与理论计算的FACTOR值差异不大，没有发现有明显影响因素，方可进行校正。
检验结果溯源性，得建立一个可靠的参考系统作为准确性基础，然后将准确性转移到常规方法测定中去，使常规方法测定结果可溯源到参考系统所提供的准确性基础上来。在实现溯源性目标过程中，永远以患者新鲜标本为实验对象，以方法学对比试验方法为验证手段。方法学对比试验常采用回归方程进行统计分析，假如斜率接近1，截距较小，这意味着实验室常规方法对标本测定结果和溯源目标参考系统对标本检测结果非常接近。
临床化学中参考标准(二标准)要有通用性，但生产厂家提供的校准液并非通用的，只适用于某一特定的分析系统。
校准液标示值往往是按其基质偏差修正的，所以标示值并非实际值。校准液、质控血清通常是经过处理的混合人或动物血清，这种制备物在特定分析系统中往往与人新鲜血清反应性不同而产生基质偏差。如总胆固醇测定基质效应研究指出：校准液酶法测定回收结果偏低可达5%~7%。
7 试剂抗干扰作用的合理性
有些液体双试剂，其实质并不真正具备抗干扰的能力而只是解决了试剂的液体化和稳定性问题。如，ALT试剂盒中，NADH在pH7.5~7.8水溶液中不稳定，在pH>8.7时才能稳定保存。因此，为了保/证试剂稳定性，液体双试剂的R1需要维持pH>8.7，但此时LDH活性大大下降，就失去消除内源性丙酮酸的功能，只有加入试剂R2后，反应混合液的pH下降至LDH适pH，在经过延迟时间60 S后，才能消除内源性丙酮酸的干扰。再如，Tfinder反应中抗Vc干扰问题：由于维生素c易氧化，样品中Vc会竞争反应生成的过氧化氢，而产生负干扰。因此，在试剂R1中加入抗坏血酸氧化酶，这种方法是有效的，但不一定有很大的意义。因为Vc干扰必须同时具备二个条件：a)Vc摄入量较多；b)采血后立即测定。实验表明离体血清中Vc在90 min后会全部被氧化。又如，使用胺类新色原。a)分子共轭结构特性使得灵敏度提高，相应可以减少样本用量，终能有效地降低干扰物的量．b)使生成胺类色素原/大吸收峰由500~520 nm移至550 nm以上，以避开黄疸、溶血干扰。如：亚铁qing化钾一H 0 ，能有效避免黄疸干扰的理论依据是亚铁qing化钾与H。0。亲和力远远大于胆红素。
甘油三酯测定，有人主张选用双试剂方法消除内源性甘油，这个方法是可行的，但忽视了一个化学平衡理论。因为所有的酯在水溶液中都不是简单地以酯的形式存在，而是以水解与酯化相平衡的形式存在。在一个平衡体系中，如果去除游离甘油，这个平衡就向生成甘油方向移动，甘油三酯就会重新水解，生成新的甘油，达到新的平衡，因此样品与R1试剂孵育时间越长，测得甘油三酯值就越低。甘油三酯测定，不仅要去除游离甘油，而且还要克服样本含量真实性发生的变化，试剂中必须加入甘油激酶，并且延迟时间要标准化。所以，一些试验项目在消除内源性物质干扰的同时，会带来样品含量真实性的变化。
1 试剂空白
试剂空白吸光度是反映试剂质量的指标。每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示该试剂的变质；如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因含酚类物质被氧化为醌而变为红色。碱性磷酸酶、r一谷氨酰转肽酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或酚基苯胺而变黄。有些试剂久置后变浑浊。这些情况均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应，在放置过程中其试剂空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降。原则上，吸光度上升的反应，其试剂空白吸光度越低越好，不能超过一个高限；相反，吸光度下降的反应，其试剂空白吸光度不能低于一个低限。因此，试剂空白吸光度限值，常作为程序参数输入仪器，如经核查超限，仪器会自动报警，提示更换试剂。需要指出的是，还原型辅酶I(或II)等投料量不足或劣质的原料，往往需要加大用量，才使“表观”吸光度上升，凑合过试剂空白核对的“关”，其后果为如下情况：
1．1 线性范围变窄 现象：高值测不高。原因：生产试剂时有效成分投料量不足；试剂成份稳定性较差。
1．2 灵敏度变低现象：酶促反应速度曲线斜率下降，测定结果有严重系统误差。原因：试剂底物浓度不足。
1．3 低值偏高 现象：试剂空白的变化曲线(吸光度VS时间)明显波动。原因：试剂自身不稳定，自行分解；工具酶纯度
不够，杂酶含量超限，导致干扰作用。
2 样品信息
样品的溶血、脂血、黄疸等会对测定结果产生非化学反应的干扰。因此，应根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，采用双波长或多波长的检测模式，并在结果计算中扣除因溶血、脂血、黄疸引起的影响，减少干扰程度。
3 测定范围
每种待测物都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超过此范围，分析仪将显示结果超过范围的提示。表示试剂已经变质，应更换合格试剂。
4 底物耗尽
使用连续监测法、两点法测定酶活性时，若酶活性非常高，底物接近被耗尽，吸光度上升或下降会超过某一吸光度变化范围，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。
5 酶的预活化
测定血清中的某些酶，如CK，离体(采血)后很容易失活。失活的原因是酶活性中心的活性基因巯基(一SH)被氧化造成的。只有通过适当的还原作用才能重新激活。如CK—NAC试剂盒即含有CK活化剂，名为N一乙酰半胱氨酸。实验研究证明，NAC对血清中已失活的CK活化过程约需180 S。这就是CK测定为什么要延迟时间较长的理论依据。在AST，ALT采用IFCC推荐方法测定时需要磷酸吡哆醛预活化。需要强调：含有活化剂的生化试剂，其测定酶活性的结果要高些。
6 校准与结果溯源性
酶的校正：要满足在同一方法学、同一测定条件、与理论计算的FACTOR值差异不大，没有发现有明显影响因素，方可进行校正。
检验结果溯源性，得建立一个可靠的参考系统作为准确性基础，然后将准确性转移到常规方法测定中去，使常规方法测定结果可溯源到参考系统所提供的准确性基础上来。在实现溯源性目标过程中，永远以患者新鲜标本为实验对象，以方法学对比试验方法为验证手段。方法学对比试验常采用回归方程进行统计分析，假如斜率接近1，截距较小，这意味着实验室常规方法对标本测定结果和溯源目标参考系统对标本检测结果非常接近。
临床化学中参考标准(二标准)要有通用性，但生产厂家提供的校准液并非通用的，只适用于某一特定的分析系统。
校准液标示值往往是按其基质偏差修正的，所以标示值并非实际值。校准液、质控血清通常是经过处理的混合人或动物血清，这种制备物在特定分析系统中往往与人新鲜血清反应性不同而产生基质偏差。如总胆固醇测定基质效应研究指出：校准液酶法测定回收结果偏低可达5%~7%。
7 试剂抗干扰作用的合理性
有些液体双试剂，其实质并不真正具备抗干扰的能力而只是解决了试剂的液体化和稳定性问题。如，ALT试剂盒中，NADH在pH7.5~7.8水溶液中不稳定，在pH>8.7时才能稳定保存。因此，为了保/证试剂稳定性，液体双试剂的R1需要维持pH>8.7，但此时LDH活性大大下降，就失去消除内源性丙酮酸的功能，只有加入试剂R2后，反应混合液的pH下降至LDH适pH，在经过延迟时间60 S后，才能消除内源性丙酮酸的干扰。再如，Tfinder反应中抗Vc干扰问题：由于维生素c易氧化，样品中Vc会竞争反应生成的过氧化氢，而产生负干扰。因此，在试剂R1中加入抗坏血酸氧化酶，这种方法是有效的，但不一定有很大的意义。因为Vc干扰必须同时具备二个条件：a)Vc摄入量较多；b)采血后立即测定。实验表明离体血清中Vc在90 min后会全部被氧化。又如，使用胺类新色原。a)分子共轭结构特性使得灵敏度提高，相应可以减少样本用量，终能有效地降低干扰物的量．b)使生成胺类色素原/大吸收峰由500~520 nm移至550 nm以上，以避开黄疸、溶血干扰。如：亚铁qing化钾一H 0 ，能有效避免黄疸干扰的理论依据是亚铁qing化钾与H。0。亲和力远远大于胆红素。
甘油三酯测定，有人主张选用双试剂方法消除内源性甘油，这个方法是可行的，但忽视了一个化学平衡理论。因为所有的酯在水溶液中都不是简单地以酯的形式存在，而是以水解与酯化相平衡的形式存在。在一个平衡体系中，如果去除游离甘油，这个平衡就向生成甘油方向移动，甘油三酯就会重新水解，生成新的甘油，达到新的平衡，因此样品与R1试剂孵育时间越长，测得甘油三酯值就越低。甘油三酯测定，不仅要去除游离甘油，而且还要克服样本含量真实性发生的变化，试剂中必须加入甘油激酶，并且延迟时间要标准化。所以，一些试验项目在消除内源性物质干扰的同时，会带来样品含量真实性的变化。
原创作者：上海岑特生物科技有限公司
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