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超纯水中内毒素的定量测定实验
点击次数：25 发布时间：2024/6/11 10:47:43
革兰氏阴性菌,如大肠杆菌（E. coli）和假单胞菌(Pseudomonads)等的细胞壁成分被认为是内毒素。它们具有一个亲水性多糖和亲脂性脂质结构，有别于它们所源自的细菌,具有高度的热稳定性和pH稳定性。内毒素属于致热源，如果它们与粘膜发生接触或者一旦它们进入血液循环，便会导致发热（参考文献详见Steck, 20061）。
根据通用的药典，在药物的生产工艺中内毒素含量不可超出所规定的限值。
在生物制药（如：免疫球蛋白）生产所需的哺乳动物细胞培养中，内毒素的出现可能会导致死亡。因此，在生物制药生产、细胞系传代，或者细胞培养过程中需要使用超纯培养基，当然也相应的需要超纯水，它们所含有的内毒素含量水平已获证明低于所规定的限值。
本研究的目的在于展示Arium pro VF系统产生的超纯水所具有的内毒素含量远远低于规定的限值，因而可用于上述各种应用。
实验方法
为了对Arium pro VF系统所生产的超纯水中的内毒素含量进行检测，我们分别采用了凝胶法和显色法来测试。
实验结果
在0.001 EU/ml-0.05 EU/ml的浓度范围内，凝胶法显示的是阴性结果，意即无凝胶形成（无内毒素检测到；见表1）；当浓度≥0.1 EU/ml时发生了凝集反应。该结果显示了在凝胶法的检测敏感限值内，在Arium pro VF系统所生产的超纯水中未出现内毒素。
显色法中，在405nm波长处的60吸附读数（见下图）根据标准样品中内毒素含量的不同生成了不同斜率的曲线。达到吸收率所需要的时间通过特殊的计算机程序进行计算，并将之用为推断具有未知内毒素含量的样品的依据（具体的值详见表1-显色测试）。由于具有/低浓度（0.005-0.001 EU/ml）的标准样品和Arium水未达到所需的计算内毒素含量的消光值，因此它们被认定为低于检测限值。
Arium pro VF超纯水所获得的值明显比0.001 EU/ml曲线的绘制点更加低。下图显示了与两个选定的内毒素标准（0.05 EU/ml ａnd 0.005 EU/ml）相比，在自来水、去离子水（DI水）和Arium水中所测得的内毒素浓度的数据集合。在水样品中的内毒素含量通过使用内毒素标准所测得的值来计算，详见表2.
在DI水样品中，检测到内毒素为0.02 EU/ml，这个值低于WFI（注射用水）现行的有效值。在自来水中，出乎意料地检测到高达25 EU/ml的内毒素载量。该结果未作进一步分析。与之相对，在系统所产生的超纯水中所检测到意料之外的低值，< 0.001 EU/ml，这个值远远低于常见的限值。
在DI水样品中，检测到内毒素为0.02 EU/ml，这个值低于WFI（注射用水）现行的有效值。在自来水中，出乎意料地检测到高达25 EU/ml的内毒素载量。该结果未作进一步分析。与之相对，在系统所产生的超纯水中所检测到意料之外的低值，< 0.001 EU/ml，这个值远远低于常见的限值。
结论
测试结果显示了Arium pro VF系统生产的超纯水可作为一种方便、实惠的选择，用于内毒素测试的样品制备，因为在其所生产的超纯水中检测到的内毒素浓度非常低（<0.001 EU/ml）。得到的结果也证实了早期关于在Arium超纯水中发现内毒素载量<0.001 EU/ml的试验。
在此超纯水中的内毒素浓度远远低于美国药典所规定的限值，这也使得该超纯水理论上适用于制药产品的生产/内毒素监测方面。相关的例子包括产品制剂，透析过滤解决方案，层析缓冲液以及用于萃取、清洗、无菌步骤和细胞培养方案的水等。
在细胞培养应用范围内，我们需要在工艺的各个步骤都对污染物保持高度警惕。为了对内毒素对细胞培养物及细胞敏感度的影响保持可控，尤其是与此类内毒素相关时，用于细胞培养的培养基都必须要明确不含可检测到的内毒素含量（见参考文献5）。
参考文献/更多信息
1 Steck, S. : Endotoxine und ihre Bedeutung bei R & D Applikationen. Bioforum 6/2006.
2 Endosafe® -PTS™ Glucan Assay, Charles River Laboratories International, Inc, 2009.
3 Endotoxin Compendium, V 2.11, Hyglos GmbH, Bernried, Germany.
4 Untersuchungsbericht Fresenius Medical Care, Deutschland GmbH, Werk St. Wendel, 2007.
5 Dawson, M.E. : LAL Update von Associates of Cape CodIncorporated, March 1998, Vol. 16, No. 1. Adapted from the original German article by Dr. Herbig, June 7, 2012
根据通用的药典，在药物的生产工艺中内毒素含量不可超出所规定的限值。
在生物制药（如：免疫球蛋白）生产所需的哺乳动物细胞培养中，内毒素的出现可能会导致死亡。因此，在生物制药生产、细胞系传代，或者细胞培养过程中需要使用超纯培养基，当然也相应的需要超纯水，它们所含有的内毒素含量水平已获证明低于所规定的限值。
本研究的目的在于展示Arium pro VF系统产生的超纯水所具有的内毒素含量远远低于规定的限值，因而可用于上述各种应用。
实验方法
为了对Arium pro VF系统所生产的超纯水中的内毒素含量进行检测，我们分别采用了凝胶法和显色法来测试。
实验结果
在0.001 EU/ml-0.05 EU/ml的浓度范围内，凝胶法显示的是阴性结果，意即无凝胶形成（无内毒素检测到；见表1）；当浓度≥0.1 EU/ml时发生了凝集反应。该结果显示了在凝胶法的检测敏感限值内，在Arium pro VF系统所生产的超纯水中未出现内毒素。
显色法中，在405nm波长处的60吸附读数（见下图）根据标准样品中内毒素含量的不同生成了不同斜率的曲线。达到吸收率所需要的时间通过特殊的计算机程序进行计算，并将之用为推断具有未知内毒素含量的样品的依据（具体的值详见表1-显色测试）。由于具有/低浓度（0.005-0.001 EU/ml）的标准样品和Arium水未达到所需的计算内毒素含量的消光值，因此它们被认定为低于检测限值。
Arium pro VF超纯水所获得的值明显比0.001 EU/ml曲线的绘制点更加低。下图显示了与两个选定的内毒素标准（0.05 EU/ml ａnd 0.005 EU/ml）相比，在自来水、去离子水（DI水）和Arium水中所测得的内毒素浓度的数据集合。在水样品中的内毒素含量通过使用内毒素标准所测得的值来计算，详见表2.
在DI水样品中，检测到内毒素为0.02 EU/ml，这个值低于WFI（注射用水）现行的有效值。在自来水中，出乎意料地检测到高达25 EU/ml的内毒素载量。该结果未作进一步分析。与之相对，在系统所产生的超纯水中所检测到意料之外的低值，< 0.001 EU/ml，这个值远远低于常见的限值。
在DI水样品中，检测到内毒素为0.02 EU/ml，这个值低于WFI（注射用水）现行的有效值。在自来水中，出乎意料地检测到高达25 EU/ml的内毒素载量。该结果未作进一步分析。与之相对，在系统所产生的超纯水中所检测到意料之外的低值，< 0.001 EU/ml，这个值远远低于常见的限值。
结论
测试结果显示了Arium pro VF系统生产的超纯水可作为一种方便、实惠的选择，用于内毒素测试的样品制备，因为在其所生产的超纯水中检测到的内毒素浓度非常低（<0.001 EU/ml）。得到的结果也证实了早期关于在Arium超纯水中发现内毒素载量<0.001 EU/ml的试验。
在此超纯水中的内毒素浓度远远低于美国药典所规定的限值，这也使得该超纯水理论上适用于制药产品的生产/内毒素监测方面。相关的例子包括产品制剂，透析过滤解决方案，层析缓冲液以及用于萃取、清洗、无菌步骤和细胞培养方案的水等。
在细胞培养应用范围内，我们需要在工艺的各个步骤都对污染物保持高度警惕。为了对内毒素对细胞培养物及细胞敏感度的影响保持可控，尤其是与此类内毒素相关时，用于细胞培养的培养基都必须要明确不含可检测到的内毒素含量（见参考文献5）。
参考文献/更多信息
1 Steck, S. : Endotoxine und ihre Bedeutung bei R & D Applikationen. Bioforum 6/2006.
2 Endosafe® -PTS™ Glucan Assay, Charles River Laboratories International, Inc, 2009.
3 Endotoxin Compendium, V 2.11, Hyglos GmbH, Bernried, Germany.
4 Untersuchungsbericht Fresenius Medical Care, Deutschland GmbH, Werk St. Wendel, 2007.
5 Dawson, M.E. : LAL Update von Associates of Cape CodIncorporated, March 1998, Vol. 16, No. 1. Adapted from the original German article by Dr. Herbig, June 7, 2012
原创作者：上海岑特生物科技有限公司
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