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海藻及海洋细菌的DNA制备方法
点击次数：317 发布时间：2021/11/2 9:36:35
众所周知，海藻由于富含多糖，DNA提取是一大难题，以下是在试验过程中收集的海藻DNA制备方法，经试验验证可行，现在贴出来，以觞众战友。
一、可大量培养的海洋细菌
1、取1ml目的菌菌液至1.5ml的EP管中，5000r/m离心5分钟弃上清，菌体加入500μl水洗涤一次，5000r/m离心5分钟，弃上清，向菌体中加入200μl悬浮缓冲液。
2、在200μl悬浮缓冲液中加人55℃Tirs饱和酚200μl和10%的SDS 45μl混匀，在微型蜗旋混和仪上混匀，55℃温浴15分钟，并且不断振荡混匀。
3、12000r/m离心5分钟，取上层水相移至新的EP管中。
4、加入等量的lv仿/异戊醇抽提，12000r/m离心5分钟，转移上层水相至新管，反复抽提至界面澄清。
5、取上层水相加入0.1倍的3M醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇混匀于-20℃放置2h沉淀DNA。
6、12000r/m离心20分钟，沉淀DNA弃上清，用预冷的的70%的乙醇洗2次，在室温下晾干，加入40μl无菌水溶解，-20℃保存。
本方法用于海洋假单孢菌、以及部分兰细菌（蓝藻）可行。
二、从海水中制备细菌/浮游生物的混合DNA
海洋浮游生物生物量较小，往往需要采集大量的海水样本，过滤收集特定粒径的浮游生物。这里介绍的是一种简单、快速、实用的符合环境指示基因PCR扩增需要的浮游生物模板DNA制备方法。
1、取40 μL水样，与等体积0.25 mol/L NaOH混合，并于25 ℃温育过夜。
2、99 ℃加热10 min，冷却至室温，简单离心收集溶液，依次加入8 μL 1 mol/L HCl，20 μL 0.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）和10 μL 2% （v/v，体积分数）Triton X-100，混合并离心。
3、将混合溶液再次在99 ℃加热10 min。
4、制备的模板DNA溶液pH值 在8到9之间，可直接用于PCR扩增反应，不需要其它纯化处理。
本方法用于海洋弧菌可行。
三、褐藻
Approximately 500mg of fresh leaves were ground in liquid nitrogen, transferred to the lysis buffer (1.5% CTAB, 75mM Tris-HCl, 1.5mM EDTA, 1.0M NaCl, 0.5mg/ml RNase A), ａnd incubated for 30 min at 65℃. Proteinase K (final concentration of 10 mg/ml) was added ａnd incubation continued for 30 min at 37℃. An equal volume of phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) was added, mixed ａnd the sample centrifuged at 2,300g for 20 min. Approximately 500μl of upper aqueous layer was transferred to a new tube ａnd 50μl of 10% CTAB (10% CTAB, 0.7 M NaCl), an equal volume of phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) was added, mixed ａnd the sample centrifuged at 2,300g for 20 min. The upper aqueous layer was transferred to a new tube ａnd an equal volume of 1% CTAB (10% CTAB, 50mM Tris-HCl, 10mM EDTA) was added, mixed ａnd the sample centrifuged at 1,000g for 10 min. The DNA was precipitated. The DNA was washed with 70% ethanol. Then the DNA pellet was air-dried ａnd redissolved in TE (Tris-EDTA) buffer.
本方法用于鼠尾藻，可行。
四、红藻
1、取1g藻体，用蒸馏水洗净，加入大约2ml提取缓冲液[4% SDS, 0.05 M Tris. HCl，pH8.0, 0.1M EDTA, 0.2MnaCl]， 在0℃冰浴中充分研磨后，加蛋白酶K(终浓度100ug/ml)，在50℃水浴 间断震荡3.5-4小时。
2、15,000 rpm离心10min，取上清液，加等体积的酚抽提, 15,000rpm离心10min。
3、取上清液，再以酚/lv仿/异戊醇(25:24:1)及lv仿抽提，15,000rpm离心10min。
4、取上清液，加入二倍体积的无水乙醇使DNA沉淀，离心，用70%的乙醇洗沉淀两次。
5、干燥后，溶解在50ul无菌TE(10mMTris, 0.1mM EDTA,PH8.0)中，-20℃储存备用。
本方法用于紫菜孢子体、紫菜配子体、江蓠、龙须菜可行。
五、甲藻
1、取对数生长-期的培养物，在 4 ℃下用 冷冻离心机6000 rpm离心 6 min，收集藻细胞。
2、收集的藻细胞放于液氮中冷冻半个小时后，在研钵中研磨成粉末，转移到 1.5mL 的灭菌离心管中，加入总体积 700μL 裂解缓冲液(100mM EDTA, pH 8.0；10 mM Tris-HCl, pH 8.0；1% SDS；200 μg/mL Protease K)放于55 ℃温浴 3 h，其间不时摇动。
3、待溶液澄清透亮裂解完-全后，用一倍体积的平衡酚抽提一次, 吸取上清转移至另一灭菌管中; 上清用一倍体积的平衡酚：lv仿（25:24）抽提一次，吸取上清移至另一灭菌管中；上清再用一倍体积的平衡酚：lv仿：异戊醇（25:24:1）抽提一次，吸取收集上清；收集的上清液加入十分体积 3 M 醋酸纳和两倍体积冰预冷的无水乙醇，-20 ℃过夜放置。
4、第二天12000 rpm离心20min后弃去上清，DNA 沉淀用 70%的乙醇洗涤两次，晾干。
5、终溶解于 50 μLTE 缓冲液 (10 mM Tris-HCl pH 8.0；1 mM EDTA)。
本方法用于塔玛亚历山大藻、原甲藻可行。
六、蓝藻（以在reply过，现在集中到这里）
solution I： 100 mM NaCl, 30 mM Tris.Cl （pH 7.8）, 10 mM EDTA
solution II：0.1 M NaCl，0.2 M蔗糖，10 mM EDTA
裂解液： 0.25 mM EDTA, 0.5 M Tris.Cl, （pH 9.2），2.5% SDS，10 mM ?-巯基乙醇
TAE： 40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA
TE： 20 mmol/l Tris. Cl (8.0), 1 mmol/l EDTA (8.0)
1、称取1 g干藻粉置于eppendorf 管中；
2、加入0.5 ml solution I，振荡1 min；
3、 10,000 rpm离心1 min，弃上清；
4、重新加入0.5 ml solution I洗涤，收集沉淀；
5、用0.6 ml solution II悬浮沉淀后，加入0.2 ml 裂解液，剧烈振荡1 min；
6、55 ?C水浴1 h；
7、加入等体积的酚/lv仿/异戊醇抽提两次（10,000 rpm, 8 min）；
8、用等体积的lv仿/异戊醇（10,000 rpm, 8 min）抽提1次后收集上清；
9、 加入1/10体积的3 M NaAc（pH 5.2）和2倍体积的无水乙醇；
10、室温沉淀20 min, 10,000 rpm离心8 min；
11、70 %乙醇洗涤沉淀除盐两次并吹干；
12、50 ?l ddH2O溶解沉淀；
13、 加入RNaseA去RNA，电泳检测后- 20 ?C保存备用。
本方法用于螺旋藻、节旋藻可行。
一、可大量培养的海洋细菌
1、取1ml目的菌菌液至1.5ml的EP管中，5000r/m离心5分钟弃上清，菌体加入500μl水洗涤一次，5000r/m离心5分钟，弃上清，向菌体中加入200μl悬浮缓冲液。
2、在200μl悬浮缓冲液中加人55℃Tirs饱和酚200μl和10%的SDS 45μl混匀，在微型蜗旋混和仪上混匀，55℃温浴15分钟，并且不断振荡混匀。
3、12000r/m离心5分钟，取上层水相移至新的EP管中。
4、加入等量的lv仿/异戊醇抽提，12000r/m离心5分钟，转移上层水相至新管，反复抽提至界面澄清。
5、取上层水相加入0.1倍的3M醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇混匀于-20℃放置2h沉淀DNA。
6、12000r/m离心20分钟，沉淀DNA弃上清，用预冷的的70%的乙醇洗2次，在室温下晾干，加入40μl无菌水溶解，-20℃保存。
本方法用于海洋假单孢菌、以及部分兰细菌（蓝藻）可行。
二、从海水中制备细菌/浮游生物的混合DNA
海洋浮游生物生物量较小，往往需要采集大量的海水样本，过滤收集特定粒径的浮游生物。这里介绍的是一种简单、快速、实用的符合环境指示基因PCR扩增需要的浮游生物模板DNA制备方法。
1、取40 μL水样，与等体积0.25 mol/L NaOH混合，并于25 ℃温育过夜。
2、99 ℃加热10 min，冷却至室温，简单离心收集溶液，依次加入8 μL 1 mol/L HCl，20 μL 0.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）和10 μL 2% （v/v，体积分数）Triton X-100，混合并离心。
3、将混合溶液再次在99 ℃加热10 min。
4、制备的模板DNA溶液pH值 在8到9之间，可直接用于PCR扩增反应，不需要其它纯化处理。
本方法用于海洋弧菌可行。
三、褐藻
Approximately 500mg of fresh leaves were ground in liquid nitrogen, transferred to the lysis buffer (1.5% CTAB, 75mM Tris-HCl, 1.5mM EDTA, 1.0M NaCl, 0.5mg/ml RNase A), ａnd incubated for 30 min at 65℃. Proteinase K (final concentration of 10 mg/ml) was added ａnd incubation continued for 30 min at 37℃. An equal volume of phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) was added, mixed ａnd the sample centrifuged at 2,300g for 20 min. Approximately 500μl of upper aqueous layer was transferred to a new tube ａnd 50μl of 10% CTAB (10% CTAB, 0.7 M NaCl), an equal volume of phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) was added, mixed ａnd the sample centrifuged at 2,300g for 20 min. The upper aqueous layer was transferred to a new tube ａnd an equal volume of 1% CTAB (10% CTAB, 50mM Tris-HCl, 10mM EDTA) was added, mixed ａnd the sample centrifuged at 1,000g for 10 min. The DNA was precipitated. The DNA was washed with 70% ethanol. Then the DNA pellet was air-dried ａnd redissolved in TE (Tris-EDTA) buffer.
本方法用于鼠尾藻，可行。
四、红藻
1、取1g藻体，用蒸馏水洗净，加入大约2ml提取缓冲液[4% SDS, 0.05 M Tris. HCl，pH8.0, 0.1M EDTA, 0.2MnaCl]， 在0℃冰浴中充分研磨后，加蛋白酶K(终浓度100ug/ml)，在50℃水浴 间断震荡3.5-4小时。
2、15,000 rpm离心10min，取上清液，加等体积的酚抽提, 15,000rpm离心10min。
3、取上清液，再以酚/lv仿/异戊醇(25:24:1)及lv仿抽提，15,000rpm离心10min。
4、取上清液，加入二倍体积的无水乙醇使DNA沉淀，离心，用70%的乙醇洗沉淀两次。
5、干燥后，溶解在50ul无菌TE(10mMTris, 0.1mM EDTA,PH8.0)中，-20℃储存备用。
本方法用于紫菜孢子体、紫菜配子体、江蓠、龙须菜可行。
五、甲藻
1、取对数生长-期的培养物，在 4 ℃下用 冷冻离心机6000 rpm离心 6 min，收集藻细胞。
2、收集的藻细胞放于液氮中冷冻半个小时后，在研钵中研磨成粉末，转移到 1.5mL 的灭菌离心管中，加入总体积 700μL 裂解缓冲液(100mM EDTA, pH 8.0；10 mM Tris-HCl, pH 8.0；1% SDS；200 μg/mL Protease K)放于55 ℃温浴 3 h，其间不时摇动。
3、待溶液澄清透亮裂解完-全后，用一倍体积的平衡酚抽提一次, 吸取上清转移至另一灭菌管中; 上清用一倍体积的平衡酚：lv仿（25:24）抽提一次，吸取上清移至另一灭菌管中；上清再用一倍体积的平衡酚：lv仿：异戊醇（25:24:1）抽提一次，吸取收集上清；收集的上清液加入十分体积 3 M 醋酸纳和两倍体积冰预冷的无水乙醇，-20 ℃过夜放置。
4、第二天12000 rpm离心20min后弃去上清，DNA 沉淀用 70%的乙醇洗涤两次，晾干。
5、终溶解于 50 μLTE 缓冲液 (10 mM Tris-HCl pH 8.0；1 mM EDTA)。
本方法用于塔玛亚历山大藻、原甲藻可行。
六、蓝藻（以在reply过，现在集中到这里）
solution I： 100 mM NaCl, 30 mM Tris.Cl （pH 7.8）, 10 mM EDTA
solution II：0.1 M NaCl，0.2 M蔗糖，10 mM EDTA
裂解液： 0.25 mM EDTA, 0.5 M Tris.Cl, （pH 9.2），2.5% SDS，10 mM ?-巯基乙醇
TAE： 40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA
TE： 20 mmol/l Tris. Cl (8.0), 1 mmol/l EDTA (8.0)
1、称取1 g干藻粉置于eppendorf 管中；
2、加入0.5 ml solution I，振荡1 min；
3、 10,000 rpm离心1 min，弃上清；
4、重新加入0.5 ml solution I洗涤，收集沉淀；
5、用0.6 ml solution II悬浮沉淀后，加入0.2 ml 裂解液，剧烈振荡1 min；
6、55 ?C水浴1 h；
7、加入等体积的酚/lv仿/异戊醇抽提两次（10,000 rpm, 8 min）；
8、用等体积的lv仿/异戊醇（10,000 rpm, 8 min）抽提1次后收集上清；
9、 加入1/10体积的3 M NaAc（pH 5.2）和2倍体积的无水乙醇；
10、室温沉淀20 min, 10,000 rpm离心8 min；
11、70 %乙醇洗涤沉淀除盐两次并吹干；
12、50 ?l ddH2O溶解沉淀；
13、 加入RNaseA去RNA，电泳检测后- 20 ?C保存备用。
本方法用于螺旋藻、节旋藻可行。
原创作者：上海岑特生物科技有限公司
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