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岑特小结：微生物实验室的菌种鉴定
点击次数：338 发布时间：2021/10/18 11:53:21
微生物检验过程中检出的微生物应该进行微生物鉴定，虽然药典里明确了鉴定到什么水平的标准和一些基础内容操作方法。但是因为实验室能力有限，很多实验室要么消抵抗要么稀里糊涂的要么完-全委外。
其实我们一般微生物实验室自己还是可以做一些工作，特别是细菌的鉴定。再就是菌种鉴定时，不是直接拿来就鉴定，需要一些预先做一些处理或判断。现将一些基础知识进行总结如下：
一、相关定义
1、生理生化鉴定：根据微生物对各种生理条件（温度、pH、氧气、渗透压）、生化指标（唯1碳氮源、抗生素、酶、盐碱性）代谢反应进行分析，并将结果转化成软件可以识别的数据，进行聚类分析，与已知的参比菌株数据库进行比较，终对未知菌进行鉴定的一种技术。
2、革兰氏染色：系细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。
3、平板划线法：系指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。
4、氧化酶试验：氧化酶不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应而进行的试验，用于区分不发酵的革兰阴性杆菌（氧化酶阳性）和肠道菌（氧化酶阴性）。
5、触酶试验：大多需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球菌属阴性，故常用此试验来鉴定，用于区分葡萄球菌(过氧化氢酶阳性）和链球菌(过氧化氢酶阴性）。
6、凝固酶试验：用于区分凝固酶阴性葡萄球菌（可推测为非致病性）和凝固酶阳性葡萄球菌(很可能为致病性）。
二、工作程序
1、微生物鉴定程序
微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定，鉴定时一般先将待检菌进行初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定，根据所需要达到的鉴定水平选择鉴定方法。目实验室室进行表型微生物鉴定后可以用API试剂条进行或其他等效的试剂条进行菌种鉴定，如API试剂条鉴定不能满足要求时采取委外鉴定。
注：为了控制成本，可以自己进行鉴定，不具备能力时再委外。API鉴定用的试剂条的效期有限，需要注意效期或跟供应商做好沟通备货。
1.1 待检菌的分离与纯化
微生物鉴定的第1步是待检培养物的分离纯化，chang用的分离纯化方法是挑去待检菌的纯培养物（单个菌落），必要时可进一步进行纯培养，为表型鉴定和随后的鉴定程序提供足够量的菌体。从药物原材料、制药用水、生产环境、中间产品和终产品的样品中检出的受损微生物，经分离纯化程序使其由不利生存易产生变化的状态变为在营养富集和-佳培养温度条件下生存的稳定状态，以保-证鉴定结果的准确性，具体详见表1。
1.1.1 平板划线法
平板划线方法一般通过连续画蛇形曲线或四区划线方法进行。四区划线具体步骤如下：先在平皿上做好标识，然后在选择所获得的新鲜菌种进行划线；左手持无菌平板，拇指和食指控制皿盖，其余指控制皿底，打开皿盖，用接种环在皿上进行划线，一区要连续紧密的几根平行线（如果菌量过多可以更换接种环），二区紧着着一区的-后一根线带出来，划几根平行线，然后三区、四区同样的操作，四区应尽量避免接触到菌落密集区，影响单菌落的形成；-后再选择适宜的温度进行培养。
1.1 .2 稀释倒平板法
先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。
如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。
1.1.3 涂布平板法
因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。
1.2 初筛实验
常规的微生物鉴定，一般要先-进行初筛试验确定待检菌的基本微生物特征，将待检菌进行初步分类。常见的初筛试验包括革兰氏染色、芽孢染色、镜检观察染色结果和细胞形态、重要的生化反应等。
1.2.1 革兰氏染色
原理：检查细菌细胞壁的渗透性，染色所有细胞是透明的，结晶紫着色后用碘增加染料与菌体结合，乙醇从G(-)菌体洗脱结晶紫，用番红液复染，革兰氏阴性菌呈粉红色，革兰氏阳性菌呈蓝紫色。
染色步骤：一般按照染色液说明书规定进行染色，如说明书无明确说明时按以下步骤进行染色。结晶紫初染，在载玻片上滴一小滴纯化水，用灼烧过的接种针挑取少量细菌，置载玻片的水滴中与水混合并涂抹开，涂抹要均匀平坦，涂抹后直径约为1 cm的薄层。
将载玻片在火焰上方快速来回通过一两次，以载玻片的加热面接触手背皮肤，不觉过烫为佳，待冷却后再在火焰上方来回通过一两次，再冷却，重复操作直到薄层干燥为止；在制好的片上滴一滴草酸铵结晶紫，染色1 min后用水洗；碘液媒染，加碘液一滴，作用1 min后用水冲洗，用过滤纸吸干；乙醇脱色，用95%乙醇脱色，脱色时间大概为30 s。水洗后用过滤纸吸干；番红复染，滴加0.5%的番红染色液一滴，染色10～30 s后，用自来水冲洗。
镜检：先低倍镜，再高倍镜，-后油镜观察，观察菌落形态与菌落颜色，菌落呈红色即革兰氏阴性菌，呈蓝紫色为革兰氏阳性菌。
1.2.2 芽孢染色
一般按照染色液使用说明进行芽孢染色。如无明确说明时按以下步骤进行芽孢染色。涂片，先在载玻片上滴一滴纯化水，用接种环灼烧过的接种针挑取少量细菌，置载玻片的水滴中与水混合并涂抹开，涂抹要均匀平坦，涂抹后直径约为1 cm的薄层。
干燥固定，将载玻片在火焰上方快速来回通过一两次，以载玻片的加热面接触手背皮肤，不觉过烫为佳，待冷却后再在火焰上方来回通过一两次，再冷却，重复操作直到薄层干燥为止。孔雀绿覆盖，用木夹夹住载玻片一端，加数滴5%孔雀绿染液覆盖涂片，在微火上加热至染料冒蒸汽并开始计时，维持5min。
冲洗，待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗载玻片背面，直至流出的水无色为止。复染，用0.5%番红染液覆盖玻片，保持3min。 水洗干燥，用缓流自来水冲洗载玻片背面，直至流出的水无色为止，使其自然干燥。镜检，观察菌落是否含有芽孢。
1.2.3 氧化酶试验（革兰氏阴性杆菌）
革兰氏阴性菌，做氧化酶试验。取将待检菌落于无菌的滤纸片上，滴加一滴氧化酶试剂，反应3分钟，出现紫色为阳性，反之为阴性。
1.2.4 非发酵菌鉴定
接种把OF培养基在沸水浴溶解，在室温冷却后,每试验分装 2个安培的固体OF培养基，利用接种针挑单个菌落,穿刺到OF培养基(深度约1cm.)，把其中一个已接种好的安培(OF.F),用石蜡油覆盖1cm. 把两个安培盖上塑料帽,培养35-37°C , 24 – 48小时。
结果判定：两瓶均为黄色，则为发酵菌，则为发酵菌，两管培养基一瓶显示绿色F-，一瓶显示黄色O+。
1.2.5 触酶试验（革兰氏阳性菌）
玻片法：挑取被捡菌落于玻片上，直接用试剂进行乳化，5s内产生气泡即为阳性结果，反之为阴性。
1.3 表型微生物鉴定
表型微生物鉴定依据表型特征的表达来区分不同微生物间的差异，是经典的微生物分类鉴定法，以微生物细胞的形态和习性表型为主要指标，通过比较微生物的菌落形态、理化特征和特征化学成分与典型微生物的差异进行鉴别。微生物分类中使用的表型特征如表2。
1.4.API试剂条的使用
1.4.1API试剂条的选条标准
根据API系统选条标准，来选择适合的API鉴别条来鉴别。如革兰氏阳性球菌：触酶试验阳性为葡萄球菌用API STAPH鉴别，触酶试验阴性为链球菌用API 20 STREP鉴别。
1.4.2API试剂条的操作步骤
1.4.2.1分离单个菌落：用一次性无菌接种环或已灭菌棉签挑单个可疑菌落，尽量避免使用高度选择性培养基。
1.4.2.2安瓿瓶的开启：盖上安瓿开启器，用手垂直握住安瓿瓶（白色塑料瓶盖朝上），尽量将瓶盖压下，用大拇指顶住瓶盖上斜面部分，同时用拇指向外加压。
1.4.2.3 制菌悬液：将挑取的单个菌落置于含0.85%氯化钠溶液或悬浮培养基5ml的安培瓶，混匀。
1.4.2.4测定菌悬液浊度：
1.4.2.5菌液的加入：将5ml无菌水放入培养盒以提供湿润的培养环境，同时放入试纸条，将菌液接种到小管或小管及小杯(CIT, VP和 GEL)，利用石腊油覆盖zhi定的生化孔 (有划线的孔ADH ，ODC， H2S 和URE)，盖上培养盖。
1.4.2.5培养：把试纸条放进培养箱内，利用zhi定温度及时间进行培养（如API20E : 35 ~ 37℃，18-24 小时）。
1.4.2.6附加试剂加入：培养结束后，按操作说明书规定，将附加试剂加进适当小孔内。
1.4.2.7结果分析：登录APIWEB,试纸条上每三个小孔（小管）作为一组，记分分别为1、2、4分，将试纸条的显色情况进行输入，进行结果对比判读。
1.4.2.8结果判读原理：
生化结果组合跟资料库内的典型条目(Taxa)作出比较，经计算後，鉴定百比率（%Id）＝机会率，指示出不同菌类的比较，T值指示出在同一个菌类的相似程度。依据T值及%Id的组合，作出评语：
ji好的鉴定结果 %Id >99.9及T>0.75
很好的鉴定结果 %Id >99.0及T>0.50
好的鉴定结果 %Id >90.0及T>0.25
可以接受的鉴定结果 %Id >80.0及T>0
可疑的生化谱 N/A
其实我们一般微生物实验室自己还是可以做一些工作，特别是细菌的鉴定。再就是菌种鉴定时，不是直接拿来就鉴定，需要一些预先做一些处理或判断。现将一些基础知识进行总结如下：
一、相关定义
1、生理生化鉴定：根据微生物对各种生理条件（温度、pH、氧气、渗透压）、生化指标（唯1碳氮源、抗生素、酶、盐碱性）代谢反应进行分析，并将结果转化成软件可以识别的数据，进行聚类分析，与已知的参比菌株数据库进行比较，终对未知菌进行鉴定的一种技术。
2、革兰氏染色：系细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。
3、平板划线法：系指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。
4、氧化酶试验：氧化酶不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应而进行的试验，用于区分不发酵的革兰阴性杆菌（氧化酶阳性）和肠道菌（氧化酶阴性）。
5、触酶试验：大多需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球菌属阴性，故常用此试验来鉴定，用于区分葡萄球菌(过氧化氢酶阳性）和链球菌(过氧化氢酶阴性）。
6、凝固酶试验：用于区分凝固酶阴性葡萄球菌（可推测为非致病性）和凝固酶阳性葡萄球菌(很可能为致病性）。
二、工作程序
1、微生物鉴定程序
微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定，鉴定时一般先将待检菌进行初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定，根据所需要达到的鉴定水平选择鉴定方法。目实验室室进行表型微生物鉴定后可以用API试剂条进行或其他等效的试剂条进行菌种鉴定，如API试剂条鉴定不能满足要求时采取委外鉴定。
注：为了控制成本，可以自己进行鉴定，不具备能力时再委外。API鉴定用的试剂条的效期有限，需要注意效期或跟供应商做好沟通备货。
1.1 待检菌的分离与纯化
微生物鉴定的第1步是待检培养物的分离纯化，chang用的分离纯化方法是挑去待检菌的纯培养物（单个菌落），必要时可进一步进行纯培养，为表型鉴定和随后的鉴定程序提供足够量的菌体。从药物原材料、制药用水、生产环境、中间产品和终产品的样品中检出的受损微生物，经分离纯化程序使其由不利生存易产生变化的状态变为在营养富集和-佳培养温度条件下生存的稳定状态，以保-证鉴定结果的准确性，具体详见表1。
1.1.1 平板划线法
平板划线方法一般通过连续画蛇形曲线或四区划线方法进行。四区划线具体步骤如下：先在平皿上做好标识，然后在选择所获得的新鲜菌种进行划线；左手持无菌平板，拇指和食指控制皿盖，其余指控制皿底，打开皿盖，用接种环在皿上进行划线，一区要连续紧密的几根平行线（如果菌量过多可以更换接种环），二区紧着着一区的-后一根线带出来，划几根平行线，然后三区、四区同样的操作，四区应尽量避免接触到菌落密集区，影响单菌落的形成；-后再选择适宜的温度进行培养。
1.1 .2 稀释倒平板法
先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。
如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。
1.1.3 涂布平板法
因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。
1.2 初筛实验
常规的微生物鉴定，一般要先-进行初筛试验确定待检菌的基本微生物特征，将待检菌进行初步分类。常见的初筛试验包括革兰氏染色、芽孢染色、镜检观察染色结果和细胞形态、重要的生化反应等。
1.2.1 革兰氏染色
原理：检查细菌细胞壁的渗透性，染色所有细胞是透明的，结晶紫着色后用碘增加染料与菌体结合，乙醇从G(-)菌体洗脱结晶紫，用番红液复染，革兰氏阴性菌呈粉红色，革兰氏阳性菌呈蓝紫色。
染色步骤：一般按照染色液说明书规定进行染色，如说明书无明确说明时按以下步骤进行染色。结晶紫初染，在载玻片上滴一小滴纯化水，用灼烧过的接种针挑取少量细菌，置载玻片的水滴中与水混合并涂抹开，涂抹要均匀平坦，涂抹后直径约为1 cm的薄层。
将载玻片在火焰上方快速来回通过一两次，以载玻片的加热面接触手背皮肤，不觉过烫为佳，待冷却后再在火焰上方来回通过一两次，再冷却，重复操作直到薄层干燥为止；在制好的片上滴一滴草酸铵结晶紫，染色1 min后用水洗；碘液媒染，加碘液一滴，作用1 min后用水冲洗，用过滤纸吸干；乙醇脱色，用95%乙醇脱色，脱色时间大概为30 s。水洗后用过滤纸吸干；番红复染，滴加0.5%的番红染色液一滴，染色10～30 s后，用自来水冲洗。
镜检：先低倍镜，再高倍镜，-后油镜观察，观察菌落形态与菌落颜色，菌落呈红色即革兰氏阴性菌，呈蓝紫色为革兰氏阳性菌。
1.2.2 芽孢染色
一般按照染色液使用说明进行芽孢染色。如无明确说明时按以下步骤进行芽孢染色。涂片，先在载玻片上滴一滴纯化水，用接种环灼烧过的接种针挑取少量细菌，置载玻片的水滴中与水混合并涂抹开，涂抹要均匀平坦，涂抹后直径约为1 cm的薄层。
干燥固定，将载玻片在火焰上方快速来回通过一两次，以载玻片的加热面接触手背皮肤，不觉过烫为佳，待冷却后再在火焰上方来回通过一两次，再冷却，重复操作直到薄层干燥为止。孔雀绿覆盖，用木夹夹住载玻片一端，加数滴5%孔雀绿染液覆盖涂片，在微火上加热至染料冒蒸汽并开始计时，维持5min。
冲洗，待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗载玻片背面，直至流出的水无色为止。复染，用0.5%番红染液覆盖玻片，保持3min。 水洗干燥，用缓流自来水冲洗载玻片背面，直至流出的水无色为止，使其自然干燥。镜检，观察菌落是否含有芽孢。
1.2.3 氧化酶试验（革兰氏阴性杆菌）
革兰氏阴性菌，做氧化酶试验。取将待检菌落于无菌的滤纸片上，滴加一滴氧化酶试剂，反应3分钟，出现紫色为阳性，反之为阴性。
1.2.4 非发酵菌鉴定
接种把OF培养基在沸水浴溶解，在室温冷却后,每试验分装 2个安培的固体OF培养基，利用接种针挑单个菌落,穿刺到OF培养基(深度约1cm.)，把其中一个已接种好的安培(OF.F),用石蜡油覆盖1cm. 把两个安培盖上塑料帽,培养35-37°C , 24 – 48小时。
结果判定：两瓶均为黄色，则为发酵菌，则为发酵菌，两管培养基一瓶显示绿色F-，一瓶显示黄色O+。
1.2.5 触酶试验（革兰氏阳性菌）
玻片法：挑取被捡菌落于玻片上，直接用试剂进行乳化，5s内产生气泡即为阳性结果，反之为阴性。
1.3 表型微生物鉴定
表型微生物鉴定依据表型特征的表达来区分不同微生物间的差异，是经典的微生物分类鉴定法，以微生物细胞的形态和习性表型为主要指标，通过比较微生物的菌落形态、理化特征和特征化学成分与典型微生物的差异进行鉴别。微生物分类中使用的表型特征如表2。
1.4.API试剂条的使用
1.4.1API试剂条的选条标准
根据API系统选条标准，来选择适合的API鉴别条来鉴别。如革兰氏阳性球菌：触酶试验阳性为葡萄球菌用API STAPH鉴别，触酶试验阴性为链球菌用API 20 STREP鉴别。
1.4.2API试剂条的操作步骤
1.4.2.1分离单个菌落：用一次性无菌接种环或已灭菌棉签挑单个可疑菌落，尽量避免使用高度选择性培养基。
1.4.2.2安瓿瓶的开启：盖上安瓿开启器，用手垂直握住安瓿瓶（白色塑料瓶盖朝上），尽量将瓶盖压下，用大拇指顶住瓶盖上斜面部分，同时用拇指向外加压。
1.4.2.3 制菌悬液：将挑取的单个菌落置于含0.85%氯化钠溶液或悬浮培养基5ml的安培瓶，混匀。
1.4.2.4测定菌悬液浊度：
1.4.2.5菌液的加入：将5ml无菌水放入培养盒以提供湿润的培养环境，同时放入试纸条，将菌液接种到小管或小管及小杯(CIT, VP和 GEL)，利用石腊油覆盖zhi定的生化孔 (有划线的孔ADH ，ODC， H2S 和URE)，盖上培养盖。
1.4.2.5培养：把试纸条放进培养箱内，利用zhi定温度及时间进行培养（如API20E : 35 ~ 37℃，18-24 小时）。
1.4.2.6附加试剂加入：培养结束后，按操作说明书规定，将附加试剂加进适当小孔内。
1.4.2.7结果分析：登录APIWEB,试纸条上每三个小孔（小管）作为一组，记分分别为1、2、4分，将试纸条的显色情况进行输入，进行结果对比判读。
1.4.2.8结果判读原理：
生化结果组合跟资料库内的典型条目(Taxa)作出比较，经计算後，鉴定百比率（%Id）＝机会率，指示出不同菌类的比较，T值指示出在同一个菌类的相似程度。依据T值及%Id的组合，作出评语：
ji好的鉴定结果 %Id >99.9及T>0.75
很好的鉴定结果 %Id >99.0及T>0.50
好的鉴定结果 %Id >90.0及T>0.25
可以接受的鉴定结果 %Id >80.0及T>0
可疑的生化谱 N/A
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