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你还不能区分蛋白互作的几种方法吗？
点击次数：354 发布时间：2021/9/9 11:47:55
理论知识点看了千千万，但是还是容易混淆概念傻傻分不清IP，Co-IP，GST-Pull Down，本文我们不止放送有IP与Co-IP区别知识要点，而且也将研究蛋白互作几种方法（酵母双杂交系统（Y2H），CO-IP的关系，GST-Pull Down）之间的区别以及优缺点简明扼要的收纳进来，看了这篇文章你还不能区分IP，Co-IP，GST-Pull Down你就来打我。话不多说，看下文：
独角戏——IP:
免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）就是用偶联相应抗体的磁珠把你要研究的蛋白X免疫沉淀下来，然后去检测它。例如蛋白X在细胞内的蛋白量不同，或者有着不同的翻译后修饰，这时就可以用X蛋白抗体+Prorein A beads来进行IP，从细胞中把蛋白X拉下，再用特异的抗体（如磷酸化，泛素化抗体）进行WB来检测蛋白X的变化。简言之，IP就是检测单个蛋白的状态（高矮胖瘦，有没有戴帽子，穿的什么衣服等等）。
众里寻她千百度——酵母双杂交系统（Y2H）：
酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物转录调控过程的认识。真核生物中基因转录需要转录激活因子的参与，真核生物的转录激活因子含有两个不同的结构域：DNA 结合结构域（DNA binding domain，DNA-BD）和DNA转录激活结构域（Activation domain，AD），这两个结构域可以独立分开，功能互不影响。BD和AD分别单独作用并不能激活转录反应，只有当二者在空间上充分接近时，才呈现完整的转录激活因子活性，使下游基因得到转录。根据这一原理，可设计酵母双杂交系统。
将两待研究蛋白（蛋白 X 与蛋白 Y）分别与 BD、AD 结构域构建融合质粒。将构建好的两个质粒转入同一酵母细胞中表达，如果两蛋白之间不存在相互作用，则下游基因（报告基因）不会转录表达；如果两个蛋白间存在相互作用，则BD与AD两结构域空间上很接近，从而下游基因（报告基因）得以转录。通过报告基因表达与否，即可判断两蛋白之间是否存在相互作用。
通常在现实情况中，与蛋白X存在潜在互作可能的候选蛋白会有好几种（Y，Z，A，B等），这时我们就可以通过酵母双杂交在体内筛选与X有相互作用的蛋白Y。
遇见爱情——Co-IP：
竟然我们在体内验证过，那么蛋白X和蛋白Y在体外是否也存在相互作用了？这个时候我们可以用到Co-IP了~
免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）的原理和IP是一样的，当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质相互作用被保留了下来，假如细胞内存在 XY 蛋白复合物，用 X（X也称为诱饵蛋白）的抗体免疫沉淀 X，那么与X 在体内结合的蛋白质 Y（Y也称为靶蛋白）也被沉淀下来。因此在细胞裂解液中加入 X 的抗体沉淀蛋白X，随后利用蛋白印迹（western blot，WB）检测沉淀中是否存在蛋白 Y，如果存在，则说明细胞内存在XY蛋白复合物，即蛋白XY存在相互作用。（在体外验证X和Y之间有联系）
在我们用酵母双杂交和Ｃo-IP双保险验证X和Y之间确实存在相互作用后，我们发现酵母双杂交和Ｃo-IP的结果都只能说明X和Y之间有相互作用，但并不能确定这种相互作用是直接的还是间接的，这个时候存在两种可能：
X与Y之间存在直接的相互作用（X和Y自由恋爱一见钟情）
也就是说也许是X与M相互作用，而Y也和M相互作用，这样，用A的抗体可以把M拉下来，但同时M又把B也拉下来了（X和Y是通过他们共同的朋友M介绍才认识然后在一起的）
要想准确确定X和Y直接的作用到底是直接的还是间接的了，这个时候我们需要祭出我们大boss——GST-Pull Down实验~
GST-Pull Down：GST-Pull down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术, 近年来越来越受到广大学者的青睐。
原理：将靶蛋白和GST组成的融合蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和支撑物,充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”（目的蛋白），洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得，此方法简单易行，操作方便。
独角戏——IP:
免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）就是用偶联相应抗体的磁珠把你要研究的蛋白X免疫沉淀下来，然后去检测它。例如蛋白X在细胞内的蛋白量不同，或者有着不同的翻译后修饰，这时就可以用X蛋白抗体+Prorein A beads来进行IP，从细胞中把蛋白X拉下，再用特异的抗体（如磷酸化，泛素化抗体）进行WB来检测蛋白X的变化。简言之，IP就是检测单个蛋白的状态（高矮胖瘦，有没有戴帽子，穿的什么衣服等等）。
众里寻她千百度——酵母双杂交系统（Y2H）：
酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物转录调控过程的认识。真核生物中基因转录需要转录激活因子的参与，真核生物的转录激活因子含有两个不同的结构域：DNA 结合结构域（DNA binding domain，DNA-BD）和DNA转录激活结构域（Activation domain，AD），这两个结构域可以独立分开，功能互不影响。BD和AD分别单独作用并不能激活转录反应，只有当二者在空间上充分接近时，才呈现完整的转录激活因子活性，使下游基因得到转录。根据这一原理，可设计酵母双杂交系统。
将两待研究蛋白（蛋白 X 与蛋白 Y）分别与 BD、AD 结构域构建融合质粒。将构建好的两个质粒转入同一酵母细胞中表达，如果两蛋白之间不存在相互作用，则下游基因（报告基因）不会转录表达；如果两个蛋白间存在相互作用，则BD与AD两结构域空间上很接近，从而下游基因（报告基因）得以转录。通过报告基因表达与否，即可判断两蛋白之间是否存在相互作用。
通常在现实情况中，与蛋白X存在潜在互作可能的候选蛋白会有好几种（Y，Z，A，B等），这时我们就可以通过酵母双杂交在体内筛选与X有相互作用的蛋白Y。
遇见爱情——Co-IP：
竟然我们在体内验证过，那么蛋白X和蛋白Y在体外是否也存在相互作用了？这个时候我们可以用到Co-IP了~
免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）的原理和IP是一样的，当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质相互作用被保留了下来，假如细胞内存在 XY 蛋白复合物，用 X（X也称为诱饵蛋白）的抗体免疫沉淀 X，那么与X 在体内结合的蛋白质 Y（Y也称为靶蛋白）也被沉淀下来。因此在细胞裂解液中加入 X 的抗体沉淀蛋白X，随后利用蛋白印迹（western blot，WB）检测沉淀中是否存在蛋白 Y，如果存在，则说明细胞内存在XY蛋白复合物，即蛋白XY存在相互作用。（在体外验证X和Y之间有联系）
在我们用酵母双杂交和Ｃo-IP双保险验证X和Y之间确实存在相互作用后，我们发现酵母双杂交和Ｃo-IP的结果都只能说明X和Y之间有相互作用，但并不能确定这种相互作用是直接的还是间接的，这个时候存在两种可能：
X与Y之间存在直接的相互作用（X和Y自由恋爱一见钟情）
也就是说也许是X与M相互作用，而Y也和M相互作用，这样，用A的抗体可以把M拉下来，但同时M又把B也拉下来了（X和Y是通过他们共同的朋友M介绍才认识然后在一起的）
要想准确确定X和Y直接的作用到底是直接的还是间接的了，这个时候我们需要祭出我们大boss——GST-Pull Down实验~
GST-Pull Down：GST-Pull down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术, 近年来越来越受到广大学者的青睐。
原理：将靶蛋白和GST组成的融合蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和支撑物,充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”（目的蛋白），洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得，此方法简单易行，操作方便。
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