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分光光度法基本原理及应用说明

点击次数：136 发布时间：2023/12/11 10:57:06

分光光度的概述
吸光光度法定义:
基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法，包括紫外可见分光光度法及红外光谱法等。
紫外可见分光光度法所用的光谱区域为200~780nm，其中紫外分光光度法为200~400nm，可见分光光度法为400~ 780nm。
红外光谱法为2.5~1000um。

分光光度法概述
分光光度法的发展历程:
初人们发现很多物质都具有颜色，例如Mn04-为紫红色，Fe3+为黄色，当含有这些物质的溶液浓度改变时，溶液颜色的深浅度也就随着改变。溶液越浓颜色越深，溶液越稀颜色越浅，因此利用比较溶液颜色深浅的方法来确定溶液中有色物质的含量，这种方法称为“目视比色法”，随后人们又认识到溶液的颜色是由于对光的选择性吸收而产生的，可以利用滤光片和光电池客观的测量溶液的浓度，从而出现了“光电比色法”。随着近代测试仪器的发展，用分光光度计代替比色计，出现了分光光度法。

分光光度法基本原理
溶液颜色与光吸收的关系日常所见的白光，如日光、白炽灯光，都是混合光，即它们是由波长400~780nm的电磁波按适当强度比例混合而成的，这段波长范围的光是人们视觉可觉察到的，所以称为可见光。当电磁波的波长小于400nm时称为紫外光，大于780nm的称为红外光，都是人们视觉觉察不到的光。互补色光:当将某两种颜色的光按适当强度比例混合时，可以形成白光，这两种色光就称为互补色光。

当一束白光(混合光)通过某溶液时，如果该溶液对可见光区各种波长的光都没有吸收，即入射光全部通过溶液，则溶液呈无色透明状。
当该溶液对可见光区各种波长的光全部吸收时，则该溶液呈黑色。

如某溶液对可见光区某种波长的光选择性地吸收，则该溶液即呈现出被吸收波长光的互补色光的颜色。
例如当一束白光通过KMnO4溶液时，该溶液选择性的吸收了绿色波长的光，而将其它的色光两两互补成白光而通过去，只剩下紫色光未被互补，所以KMnO4溶液呈现紫色。

光吸收曲线
光吸收曲线:将不同波长的光依次通过某一定浓度和一定厚度的溶液，分别测出它对各种波长光的吸光度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制成的曲线(亦称吸收光谱)/大吸收波长(Aμaξ) :在吸收曲线上吸收峰/大处所对应的波长。

标准曲线的绘制
配制一系列不同浓度的标准溶液，在一定条件下显色，使用同样厚度的吸收池，测定吸光度，上然后以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得一条直线，在同样条件下测出试样溶液的吸光度就可以从工作曲线上查出试样溶液的浓度。但在实际工作中经常发现标准曲线不成直线的情况，特别是当吸光物质的浓度高时，明显的向上或向下偏离标准曲线，这种情况称为偏离朗伯-比耳定律现象。

引起偏离朗伯-比尔定律的原因
(1)入射光为非单色光。严格讲朗伯-比耳定律只适用于单色光。应选用Aμaξ处或肩峰处测定。
(2)溶液中的化学反应。离解、络合、缔合会破坏线性关系，应控制条件(酸度、浓度、介质等)。
(3)比耳定律的局限性引起偏离。严格说，比耳定律是一个有限定律，它只适用于浓度小于0.01mol/L的稀溶液。

原创作者：上海岑特生物科技有限公司