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技术文章/ARTICLE

慢病毒包装的技术原理及现状

点击次数：415 发布时间：2021/8/17 10:27:53

　　慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达siRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达siRNA/miRNA,实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高-校地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA/miRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。

慢病毒包装的原理

慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

慢病毒包装的简单流程

1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。

2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。

3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含you病毒的上清培养液。

4）病毒的纯化和浓缩。

5）分装，- 80 ℃保存。

6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。

慢病毒包装存在的问题

尽管慢载体的研究有了很大进展，但距离临床应用还有很长的路要走。先，重组病毒的滴度还不够高，除Naldini等报道的结果外，其余均在101TU/ml~103TU/ml之间，难以达到体内应用的需要；其次，由于HIV复杂的生物学性质，要像目常用的小鼠逆转录病毒载体那样建立稳定的HIV载体包装细胞十分困难，已建立的包装细胞均不理想。据报道，Vpr是一种使细胞进入静止期的强诱导剂，也是建立包装细胞的主要障碍。如果确如文所述，包装质粒中的vpr基因并非必需、去除后不影响载体的转导能力，则建立稳定的包装细胞是大有希望的。

在保-证HIV-1载体的安全性上，迄已做了种种努力，要产生有复制力的HIV,必须在不同的质粒上发生多次非同源重组事件。即使如此，一旦用于人体试验，仍然不能打消人们对感染有复制力的HIV-1的顾虑。更为谨慎的做法是，以非人类的慢病毒为基础构建载体，如猴免疫缺损病毒（SIV）、猪和牛免疫缺损病毒（FIV和BIV）、马传染性贫血病病毒等，而目这些工作尚属空白。