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两大蛋白质染色主流方法大比较
点击次数：511 发布时间：2021/5/26 10:17:11
常用的蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中考马斯亮蓝染色法的应用较为广泛，现将其与其他的蛋白质染色方法(主要是银染法)作一比较，帮助大家更好地去选择合适的蛋白质染色方法。
蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。
其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法(Coomasie brilliant blue，CBB)为代表，在蛋白质分析中常用，但对低丰度蛋白质的显现较差;银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容;荧光染色以SYPRO试剂为主。
蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作为常规方法使用;而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题。因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组 研究所需。
由于考马斯亮蓝染色法的广泛运用，近年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许多改进，方法众多，评价不一。
我们在作双向凝胶电泳 时，将常用的几种考马斯亮蓝染色法及银染进行了比较，并就其染色影响因素作出分析。
细胞总蛋白质的提取
取4份经常规培养的急性早幼粒白血病细胞株(NB4)1×107细胞各重悬于350 μl蛋白质裂解缓冲液中(8mol/L Urea，2g/L CHAPS，2mmol/L TBP，2ml/L Carrier Ampholyte，痕量溴酚兰)，置冰浴中超声裂解，静置30分钟，15500×g离心30分钟，取上清，进行蛋白质定量。
单向定量电泳
取蛋白质分子量标准物，第1次按1∶2稀释后，以后按1∶3倍比例逐稀释，经4稀释后，取15μl上样液上样，β-半乳糖苷酶上样量依次分别为1μg、 0.24μg、0.062μg、0.0156μg、0.004μg。作12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶单向电泳，同时电泳4份胶，显色以确定染色灵敏度。
双向电泳
取 300μl样品液沿水化盘中槽的边缘自左向右线性加入，将17cm IPG胶条胶面朝下置于槽中，静置45分钟后覆盖矿物油，在20℃溶胀11～16小时。溶胀后的胶条置于等电聚焦盘中，在Protean IEF Cell中进行等电聚焦，温度设置为20℃，电压模式设置为：快速升压，250 V，0.5小时;500 V，0.5小时;10000 V，60000 Vh(伏特×小时)。
取IEF后的IPG 胶条，先后分别置于含DTT平衡液1(6mol/L urea，2g/L SDS，0.05mol/L Tris pH 8.8，200ml/L gylcecol，2g/L)及含碘乙酰胺平衡液2(同平衡液1，但其中DTT换为2.5g/L 碘乙酰胺)中轻微摇荡各10分钟。将平衡好的IPG 胶条置于预先灌制的12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，封固，在15℃低温水循环条件下，15 mA/gel电泳15分钟，然后以25mA/gel恒流电泳。
显色
取出SDS-聚丙烯酰胺凝胶，经超纯水清洗2次，每次1分钟，4块胶分别按4种不同的染色方法显色。下列每步操作皆在摇床上进行。4种染色法成份组成及操作如下： ①传统考马斯亮蓝染色法：清洗后的凝胶经固定液(45.4%甲醇、4.6%乙酸)固定1小时，随后用染色液(45.4%甲醇、4.6%乙酸、0.1% CBB G250)着色过夜，再经洗脱液(5%甲醇、7.5%乙酸)过夜脱色至背景清晰。
②胶体考马斯亮蓝染色法(colloidal Coomassie brilliant blue，cCBB)染色法：凝胶先经超纯水漂洗后，再用colloidal Coomassie blue G250染色液(1.6%磷酸、8%硫酸铵、0.02% CBB G250、20%乙醇)着色过夜，洗脱液为超纯水，换液3～4次直至背景清晰。
③改良考马斯亮蓝染色法(modified Coomassie brilliant blue，mCBB)染色法[6];操作方法同胶体考马斯亮蓝染色法，只是染色液组成不同(0.12% CBB G250、10%硫酸铵、10%磷酸、20%乙醇)，着色1小时即可。
④银染(silver staining)：凝胶漂洗后先被固定液(50%甲醇+ 5%乙酸)固定1小时，随后分别用50%甲醇和超纯水清洗各10分钟，0.02 mg/L Na2S2O3 致敏1分钟，超纯水清洗2次，每次1分钟，再用预冷的0.15% AgNO3着色20分钟，超纯水再次清洗2次，每次1分钟，2% Na2CO3 + 0.04% 甲醛显色20～30，当溶液变黄以后除去，换新鲜的溶液后继续显色直至显色适度后，以5%乙酸终止显色。
成像、分析、质谱鉴定
脱色后，凝胶经GS-800 Calibrated Densitometer扫描成像，用PDQuest软件进行分析。切取蛋白质点，胰酶消化，行质谱鉴定。
结果
4种染色法的蛋白质检测灵敏性分析
β-半乳糖苷酶的上样量依次分别为1、0.24、0.062、0.0156和0.004μg。
经传统考马斯亮蓝染色后的条带在62ng水平隐隐可见;而胶体考马斯亮蓝染色法的灵敏度稍高，62ng条带明显可见;改良考马斯亮蓝染色法的效果更好些，在15.6ng水平可见条带的显示;而银染法灵敏度蕞高，在15.6ng水平可见清晰条带的显现，同时在4ng可见隐约条带。
4种染色法的比较显示，灵敏度蕞高的是银染法，可达纳克水平，其次为改良考马斯亮蓝染色法，10纳克蛋白质能被检测。而胶体考马斯亮蓝染色法和经典考马斯亮蓝染色法稍差，检测水平仅达几十纳克。
4种染色法的双向电泳蛋白质点显示比较
来自NB4细胞的全蛋白经pH 3-10NL的等电点梯度分离，SDS-PAGE 二维垂直电泳后被3种考染法着色成像的显示可以看出传统考马斯亮蓝染色法的蛋白质点显现蕞少，胶体考马斯亮蓝染色法的蛋白质点显现较多，而改良考马斯亮蓝染色法的蛋白质点显现更多。
凝胶背景以后二者为更清晰。经PDQuest软件进行分析，3幅图的蛋白质点显现数分别为483、679、890。NB4细胞的全蛋白经pH 5-8 IPG分离，分别经改良考马斯亮蓝染色法与银染法着色成像的蛋白点显示，二者上样量一致，蛋白点的显现数量相当，但银染的蛋白点明显显示着色重。这与单向电泳的效果相同。
4种染色法的可操作性比较
在比较其蛋白质检测灵敏性的同时，对染色法的操作简便性、安全性以及蛋白质经质谱鉴定的成功率也作了对比。比较显示，考马斯亮蓝染方法简便，但耗时较长，经改进后可以做到无毒操作，质谱兼容性较高。
银染步骤繁多，但耗时短;操作过程中有甲醇、甲醛等毒性物的接触，质谱兼容性低。即使我们选择的银染法被文献报道为质谱兼容的，但仍然表现为低的蛋白鉴定率，不及考马斯亮蓝染。
蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。
其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法(Coomasie brilliant blue，CBB)为代表，在蛋白质分析中常用，但对低丰度蛋白质的显现较差;银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容;荧光染色以SYPRO试剂为主。
蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作为常规方法使用;而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题。因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组 研究所需。
由于考马斯亮蓝染色法的广泛运用，近年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许多改进，方法众多，评价不一。
我们在作双向凝胶电泳 时，将常用的几种考马斯亮蓝染色法及银染进行了比较，并就其染色影响因素作出分析。
细胞总蛋白质的提取
取4份经常规培养的急性早幼粒白血病细胞株(NB4)1×107细胞各重悬于350 μl蛋白质裂解缓冲液中(8mol/L Urea，2g/L CHAPS，2mmol/L TBP，2ml/L Carrier Ampholyte，痕量溴酚兰)，置冰浴中超声裂解，静置30分钟，15500×g离心30分钟，取上清，进行蛋白质定量。
单向定量电泳
取蛋白质分子量标准物，第1次按1∶2稀释后，以后按1∶3倍比例逐稀释，经4稀释后，取15μl上样液上样，β-半乳糖苷酶上样量依次分别为1μg、 0.24μg、0.062μg、0.0156μg、0.004μg。作12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶单向电泳，同时电泳4份胶，显色以确定染色灵敏度。
双向电泳
取 300μl样品液沿水化盘中槽的边缘自左向右线性加入，将17cm IPG胶条胶面朝下置于槽中，静置45分钟后覆盖矿物油，在20℃溶胀11～16小时。溶胀后的胶条置于等电聚焦盘中，在Protean IEF Cell中进行等电聚焦，温度设置为20℃，电压模式设置为：快速升压，250 V，0.5小时;500 V，0.5小时;10000 V，60000 Vh(伏特×小时)。
取IEF后的IPG 胶条，先后分别置于含DTT平衡液1(6mol/L urea，2g/L SDS，0.05mol/L Tris pH 8.8，200ml/L gylcecol，2g/L)及含碘乙酰胺平衡液2(同平衡液1，但其中DTT换为2.5g/L 碘乙酰胺)中轻微摇荡各10分钟。将平衡好的IPG 胶条置于预先灌制的12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，封固，在15℃低温水循环条件下，15 mA/gel电泳15分钟，然后以25mA/gel恒流电泳。
显色
取出SDS-聚丙烯酰胺凝胶，经超纯水清洗2次，每次1分钟，4块胶分别按4种不同的染色方法显色。下列每步操作皆在摇床上进行。4种染色法成份组成及操作如下： ①传统考马斯亮蓝染色法：清洗后的凝胶经固定液(45.4%甲醇、4.6%乙酸)固定1小时，随后用染色液(45.4%甲醇、4.6%乙酸、0.1% CBB G250)着色过夜，再经洗脱液(5%甲醇、7.5%乙酸)过夜脱色至背景清晰。
②胶体考马斯亮蓝染色法(colloidal Coomassie brilliant blue，cCBB)染色法：凝胶先经超纯水漂洗后，再用colloidal Coomassie blue G250染色液(1.6%磷酸、8%硫酸铵、0.02% CBB G250、20%乙醇)着色过夜，洗脱液为超纯水，换液3～4次直至背景清晰。
③改良考马斯亮蓝染色法(modified Coomassie brilliant blue，mCBB)染色法[6];操作方法同胶体考马斯亮蓝染色法，只是染色液组成不同(0.12% CBB G250、10%硫酸铵、10%磷酸、20%乙醇)，着色1小时即可。
④银染(silver staining)：凝胶漂洗后先被固定液(50%甲醇+ 5%乙酸)固定1小时，随后分别用50%甲醇和超纯水清洗各10分钟，0.02 mg/L Na2S2O3 致敏1分钟，超纯水清洗2次，每次1分钟，再用预冷的0.15% AgNO3着色20分钟，超纯水再次清洗2次，每次1分钟，2% Na2CO3 + 0.04% 甲醛显色20～30，当溶液变黄以后除去，换新鲜的溶液后继续显色直至显色适度后，以5%乙酸终止显色。
成像、分析、质谱鉴定
脱色后，凝胶经GS-800 Calibrated Densitometer扫描成像，用PDQuest软件进行分析。切取蛋白质点，胰酶消化，行质谱鉴定。
结果
4种染色法的蛋白质检测灵敏性分析
β-半乳糖苷酶的上样量依次分别为1、0.24、0.062、0.0156和0.004μg。
经传统考马斯亮蓝染色后的条带在62ng水平隐隐可见;而胶体考马斯亮蓝染色法的灵敏度稍高，62ng条带明显可见;改良考马斯亮蓝染色法的效果更好些，在15.6ng水平可见条带的显示;而银染法灵敏度蕞高，在15.6ng水平可见清晰条带的显现，同时在4ng可见隐约条带。
4种染色法的比较显示，灵敏度蕞高的是银染法，可达纳克水平，其次为改良考马斯亮蓝染色法，10纳克蛋白质能被检测。而胶体考马斯亮蓝染色法和经典考马斯亮蓝染色法稍差，检测水平仅达几十纳克。
4种染色法的双向电泳蛋白质点显示比较
来自NB4细胞的全蛋白经pH 3-10NL的等电点梯度分离，SDS-PAGE 二维垂直电泳后被3种考染法着色成像的显示可以看出传统考马斯亮蓝染色法的蛋白质点显现蕞少，胶体考马斯亮蓝染色法的蛋白质点显现较多，而改良考马斯亮蓝染色法的蛋白质点显现更多。
凝胶背景以后二者为更清晰。经PDQuest软件进行分析，3幅图的蛋白质点显现数分别为483、679、890。NB4细胞的全蛋白经pH 5-8 IPG分离，分别经改良考马斯亮蓝染色法与银染法着色成像的蛋白点显示，二者上样量一致，蛋白点的显现数量相当，但银染的蛋白点明显显示着色重。这与单向电泳的效果相同。
4种染色法的可操作性比较
在比较其蛋白质检测灵敏性的同时，对染色法的操作简便性、安全性以及蛋白质经质谱鉴定的成功率也作了对比。比较显示，考马斯亮蓝染方法简便，但耗时较长，经改进后可以做到无毒操作，质谱兼容性较高。
银染步骤繁多，但耗时短;操作过程中有甲醇、甲醛等毒性物的接触，质谱兼容性低。即使我们选择的银染法被文献报道为质谱兼容的，但仍然表现为低的蛋白鉴定率，不及考马斯亮蓝染。
原创作者：上海岑特生物科技有限公司
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