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怎么处理植物组织培养过程中出现的各种污染?

点击次数:614   发布时间:2021/3/17 10:20:47

植物组织培养常见问题解析

1. 培养基的配制注意事项

植物组织培养蕞常用到 MS 培养基,包含十几种化合物。因为有些化合物相遇会发生化学反应产生沉淀,影响培养基的营养成分,准备 MS 培养基需要配制多种高倍母液。且配制母液时,尤其涉及大量元素的母液时,定要等种成分溶解之后,再缓慢的添加另种成分,切记「锅煮」,即不能将各种化合物齐添加进去。可选用 Coolaber 的 MS 培养基基盐(PM1011)在自行加入蔗糖和琼脂配制 MS 培养基,既经济,更高效。

2. 灭菌后培养基不凝胶或者凝胶偏软

植物凝胶、琼脂都对酸性条件敏感,pH 值低于 5 很难成胶或凝胶偏软,切记高压灭菌调节培养基 pH 值(5.5 - 6.0)。植物凝胶对二价阳离子浓度有要求,也就是相对于 MS 培养基,1 / 2MS 培养基中植物凝胶要适当增加用量。另外灭菌后,倒出培养基定将培养基摇匀(带防烫手套),因为是琼脂密度大底层含量高,容易造成培养基强度不均匀。选择 Coolaber 改良 MS 培养基(PM10121,pH5.8±0.2)含蔗糖和琼脂/植物凝胶,可以省去调 pH 步骤。

3. 水解酪蛋白有酸水解和酶水解之分,在使用过程中有无区别?

水解酪蛋白对胚状体、不定芽的分化有良好的促进作用,通常用量在 500 mg/L,不管是酸解还是酶解,作用都是样的,酶解更有利于发挥其作用。

4. 怎么溶解组培常用植物激素?

IAA、IBA、GA、玉米素、多效唑等应先溶解于少量 95% 的乙醇中,再加水定容配制成母液;如有结晶析出,可考虑用 1 / 10 体积的乙醇溶解后再定容;2,4 -D 易溶于碱性水溶液,可用少量 1mol/L 的 NaOH 溶液溶解后再慢慢加水定容;KT 和 6 -BA 先用少量的 HCL 溶解,再加水定容到定的浓度。

5. 细胞分裂素使用浓度?

般情况下在培养基中加入 0.1~10.0 mg/L 的细胞分裂素(6 -BA/KT/ZT),多数用 1.0~2.0 mg/L,KT 浓度为 0.5~2 mg/L,这个也要根据实验材料来调整。细胞分裂素可以单独使用也可以与细胞生长素配合使用。

6. 哪些植物激素能高压灭菌,哪些不能高压灭菌。

IBA、NAA、6 -BA、2,4 -D 可高温高压灭菌。 IAA、GA3、茉莉酸等不可高温高压灭菌,否则会分解失效,该类植物激素配制母液后需用 0.22 微孔滤膜过滤除菌,待培养基冷却(50 - 60℃)后尚未凝胶加入混匀。

7. 培养基的 pH 值会凝胶硬度有无影响。

有影响。若将培养基 pH 值调的过高(大于 6),则培养基偏硬,增加接种的阻力,会对外植体造成损伤。若将培养基 pH 值调的过低(小于 4.5),则培养基不能凝固,起不到固定外植体的作用。般将培养基的 pH 调节至 5.5~6.0 为宜。

8. 灭菌过程会否影响培养基的 pH 值?

培养基中的蔗糖和激素在高温灭菌过程中容易酸化,培养基 pH 值灭菌后会有所下降,灭菌培养基的 pH 值偏低可能导致培养基不凝或偏软。要求偏酸性的培养基可适当增加琼脂或植物凝胶的用量。

9. 应用 75% 的酒精进行种子消毒的过程中需要注意的问题

种子在消毒过程中使用 75% 的酒精使用应慎重,酒精渗透力强,消毒时间过长会直接影响种子发芽率,所以建议消毒时间不应超过 1 min。

10. 原始繁殖材料的消毒

组培中,作为原始繁殖材料的外植体消毒,直接影响整个培养过程的进行。从室外采回来的外植体需进行消毒,先用自来水冲洗外植体,冲洗时间可根据采集部位不同而定,般在 5~15 分钟即可;关键在于在超净台中进行药剂的处理,常用的药剂处理有 70% 的乙醇溶液、9% 的次氯-酸钠溶液、和 0.1~0.2% 的升-汞溶液,具体可根据实验材料而定。应注意的是经升-汞灭菌的外植体必须用无菌水冲洗 6~8 次。

11. 怎么处理植物组织培养过程中出现的各种污染?

植物组织培养过程中的污染来源主要分为 3 种,真菌、细菌和组织培养过程中的污染源。在操作过程中,难免有菌落入培养基或植物材料上,而导致污染。另外,不正确操作也会增加污染机率。预防措施:通风,保持室内空气干燥,紫外杀菌等。污染物品和污染培养基不要在培养室近距离开瓶洗刷。

原创作者:上海岑特生物科技有限公司

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