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测定蛋白浓度三种常见方法

点击次数：500 发布时间：2021/3/16 10:16:58

酪安酸差色光谱法：
1. 打开分光光度剂，预热30分钟，是紫外灯处于稳定发光状态
2. 在2容积为1mlde 微量石英比色杯中分别加入900ulPH7.4,PH12.0的0.1mol/l磷酸缓冲液，把盛有PH12.0缓冲液的比色杯放入样品杯中放入支架上，把盛有PH7.4缓冲液的比色杯放入到参比杯的支架上，然后准确的测出295nm波长下的光吸收值，或用250－350nm扫描
3. 在上述的2个比色杯中分别加入100UL的待测样品液，小心振荡混匀
4. 重复2操作
5. 计算蛋白浓度：﹝(PH为12.0A295-PH为7.4A295)/2.330×N﹞×W
N是蛋白分子中酪安酸毫摩尔消光系数之差
W是样品稀释倍数

紫外光吸收法测定蛋白浓度：
1．用品和仪器：紫外分光光度剂，微量自动取液仪
2．试剂：标准蛋白质溶液：准确称重的纯净蛋白质，配成1mg/ml储液置于4度中备用
0.1mol/l磷酸缓冲液，PH7.4;0.1mol/l磷酸缓冲液，PH12.0
3.试验程序：
1，在2个洁净干净的石英比色杯中（内径1cm）中加入蒸馏水或其他用于溶解标准蛋白质与待测样品的缓冲液，其中个作为参比杯（在以后测量不变），另个作为样品杯，放入分光光度剂的相应位置
2，记录下空白杯在280260nm处的光吸收值，或对之进行250－350nm波长范围的基线扫描
3，移去样品比色杯中的蒸馏水或是缓冲液，干燥比色杯（用滤纸吸取残液）
4，在样品比色杯中加入待测样品液，在实验中提取样品30ul加入2970ul双证水，混匀，样品液事先通过离心或用0.2um孔径的滤膜过滤
5，重复2步骤
6．蛋白含量计算：蛋白浓度（mg/ml）=1。55A280—0.76A260

Folin法测定蛋白含量：
1.用品和仪器：分光光度剂，试管及试管架，微量自动取液仪（20，100，200，1000UL）
2.试剂：试剂甲：贮液A(4g/100mlNa2CO3),贮液B(0.2mol/100lNaOH),贮液C(1g/100mlCuSO4.5H2O),贮液D（2g/100ml 酒石酸钾钠）临用将A和B等体积混合为碳酸钠－氢氧-化钠溶液，C与D混合盛Folin-酚试剂甲，天内有效
试剂乙：取乌酸钠100G，目酸钠25G，置于2000ml膜口回流装置内，加蒸馏水700ml，85％磷酸50ml和浓盐酸100ml，充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10小时（烧瓶中加入玻璃珠以防溶液外溅）再加入硫酸锂150g蒸馏水50ml及液-溴数滴，在通风厨开口煮沸15分钟，以除去多余的溴，冷却后定容与1000ml，过滤即成Folin-酚试剂乙贮存液，颜色为鲜黄色，置于棕色瓶中，可在冰箱长期保存，颜色变绿，在加几滴溴，煮沸数分钟，恢复原色试剂乙在使用应该确定其酸度，使之滴定标准氢氧-化钠试剂(1mol/l),以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红－紫红－紫灰－墨绿即可为终点，酸度为2MOL/L将其稀释到1mo/l即可
标准蛋白质溶液：精-确称取结晶牛血清蛋白3mg溶于双证水中，定容于10ML,浓度为0.3mg/ml
3.实验方法：1.取16mm*150mm试管13支，标明号码，放置与试管架，在1－11号试管中分别加入标准牛蛋白血清（0.3mg/ml）0,0.1,0.2－－－－－－－－1.0ml,补足双蒸水至每管体积1.0ml，在12，13管中加入待测样品100UL，并补足双蒸水至1.0ml
3. 加入5.0ml新配置的试剂甲，立即混匀，在室温下放置10分钟
4. 各管中加入0.5ml试剂乙，充分混匀，（用振荡器），然后室温放置30－60min
5. 将标准样及待测样品在可见光光度计上比色，如果蛋白含量低于500UG/ML,在750nm下比色，如果在100ug/ml之内，则在550nm波长下比色
6. 根据已知含量的标准样品测得的光吸收值做标准曲线，然后根据待测样品的光吸收值在标准曲线上查出蛋白含量

原创作者：上海岑特生物科技有限公司