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微生物鉴定中常用的生化反应
点击次数：438 发布时间：2020/11/18 10:49:26
实验方法原理
1. 有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。
2. 细菌产生的脂肪酶能分解培养基中的脂肪生成甘油及脂肪酸。脂肪酸可以使培养基pH下降，可通过在油脂培养基中加入中性红做指示剂进行测试。中性红指示范围为pH6.8（红）——8.0（黄）。当细菌分解脂肪产生脂肪酸时，则菌落周围培养基中出现红色斑点。
3. 某些细菌分泌蛋白酶分解明胶，产生小分子物质。如果细菌具有分解明胶的能力，则培养基可由原来固体状态变成液体状态。
4. 牛乳中主要含有乳糖、酪蛋白等成分。细菌对牛乳的利用主要是指对乳糖及酪蛋白的分解和利用。牛乳中常加入石蕊作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊中性时呈淡紫色，酸性时呈红色，碱性时呈蓝色，还原时则部分或全部脱色。细菌对牛乳的利用可分三种情况：（1）酸凝固作用：细菌发酵乳糖后，产生许多酸，使石蕊牛乳变红，当酸度很高时，可使牛乳凝固，此称为酸凝固。（2）凝乳酶凝固作用：某些细菌能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，这种凝固在中性环境中发生。通常这种细菌还具有水解蛋白质的能力，因而产生氨等碱性物质，使石蕊变蓝。（3）胨化作用：酪蛋白被水解，使牛乳变成清亮透明的液体。胨化作用可以在酸性条件下或碱性条件下进行，一般石蕊色素被还原褪色。
实验材料
大肠杆菌 枯草杆菌 金黄色葡萄球菌 产气肠杆菌 铜绿假单胞菌 黏乳产碱杆菌 普通变形杆菌
试剂、试剂盒
油脂培养基 淀粉培养基 明胶液化培养基 石蕊牛乳培养基
仪器、耗材
平皿 接种环 酒精灯 试管 接种针
一、 淀粉水解试验
1. 准备淀粉培养基平板：将熔化后冷却至50℃左右的淀粉培养基倒入无菌平皿中，待凝固后制成平板。
2. 接种：用记号笔在平板底部划成两部分，在每部分分别写上菌名，用接种环取少量的待测菌，点接在培养基表面的相对应部分的中心，其中一个菌种应是枯草杆菌做对照菌
3. 培养：将接种后的平皿置于28℃恒温箱培养24h。
4. 检测：取出平板，打开平皿盖，滴加少量的碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板。菌落周围如出现无色透明圈，则说明淀粉已经被水解，表示该细菌具有分解淀粉的能力。可以用透明圈大小说明测试菌株水解淀粉能力的强弱。
二、油脂水解试验
1. 将装有油脂培养基的三角瓶置于沸水浴中熔化，取出并充分振荡，使油脂均匀分布，再倾入无菌平皿中，待凝固成平板。
2. 接种：于同一平皿的两边接种，其中一种是金黄色葡萄球菌作为对照菌。置于37℃恒温箱培养24h，取出后观察平板菌苔颜色，如果出现红色斑点，即说明脂肪被水解了，此反应为正反应。红色斑点大小说明测试菌株水解脂肪能力的强弱。
三、明胶液化试验
1. 接种：用穿刺接种法接种大肠杆菌或产气肠杆菌于明胶培养基中。
2. 培养：放20℃恒温箱中培养48h。若细菌在20℃下不长，则应放在*适温度下培养。
3. 观察结果：观察培养基有无液化情况及液化后的形状。因明胶在低于20℃时凝固，高于25℃时自行液化，若是在高于20℃下培养的细菌，观察时应放在冰浴中观察，若明胶被细菌液化，即使在低温下明胶也不会再凝固。
四、石蕊牛乳试验
1. 接种：将黏乳产碱杆菌和铜绿假单胞菌接种入石蕊牛乳培养基中。
2. 培养：将接种后的试管于37℃恒温培养7d，另外保留一支不接种的石蕊牛乳培养基作为对照。
3. 结果观察：取出培养物，以不接种任何细菌的试管为对照，观察接种不同细菌生长后的变化情况。
五、甲基红试验(M.R.试验)
将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，32℃培养?24h，加甲基红指示剂数滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。
注意事项
1. 在淀粉水解实验中，观察各种细菌的生长情况，加入碘液时要轻轻旋转，使得碘液均匀铺满整个平板。
2. 每个实验需要设置阴性和阳性对照组，以保证实验结果。
3. 细胞生长较快，需要及时观察和记录。
4. 接种前要用记号笔做好标记，接种时要对号接种。
其他
1.如何解释淀粉酶为胞外酶而非胞内酶：淀粉为大分子物质，进入细胞很困难，甚至需要高耗能的胞吞作用，因而通过胞外酶的作用，将淀粉水解为较小分子葡萄糖后再运入细胞内，不需要高耗能的胞吞作用。
2. 碘液的作用：由于淀粉经过水解会生成葡萄糖，葡萄糖为多羟基醛，因此可以利用醛这个基团的特征性质进行验证，比如银镜反应，斐林试剂等，呈阳性说明淀粉水解产生葡萄糖。阴性则说明淀粉没有被水解。
1. 有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。
2. 细菌产生的脂肪酶能分解培养基中的脂肪生成甘油及脂肪酸。脂肪酸可以使培养基pH下降，可通过在油脂培养基中加入中性红做指示剂进行测试。中性红指示范围为pH6.8（红）——8.0（黄）。当细菌分解脂肪产生脂肪酸时，则菌落周围培养基中出现红色斑点。
3. 某些细菌分泌蛋白酶分解明胶，产生小分子物质。如果细菌具有分解明胶的能力，则培养基可由原来固体状态变成液体状态。
4. 牛乳中主要含有乳糖、酪蛋白等成分。细菌对牛乳的利用主要是指对乳糖及酪蛋白的分解和利用。牛乳中常加入石蕊作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊中性时呈淡紫色，酸性时呈红色，碱性时呈蓝色，还原时则部分或全部脱色。细菌对牛乳的利用可分三种情况：（1）酸凝固作用：细菌发酵乳糖后，产生许多酸，使石蕊牛乳变红，当酸度很高时，可使牛乳凝固，此称为酸凝固。（2）凝乳酶凝固作用：某些细菌能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，这种凝固在中性环境中发生。通常这种细菌还具有水解蛋白质的能力，因而产生氨等碱性物质，使石蕊变蓝。（3）胨化作用：酪蛋白被水解，使牛乳变成清亮透明的液体。胨化作用可以在酸性条件下或碱性条件下进行，一般石蕊色素被还原褪色。
实验材料
大肠杆菌 枯草杆菌 金黄色葡萄球菌 产气肠杆菌 铜绿假单胞菌 黏乳产碱杆菌 普通变形杆菌
试剂、试剂盒
油脂培养基 淀粉培养基 明胶液化培养基 石蕊牛乳培养基
仪器、耗材
平皿 接种环 酒精灯 试管 接种针
一、 淀粉水解试验
1. 准备淀粉培养基平板：将熔化后冷却至50℃左右的淀粉培养基倒入无菌平皿中，待凝固后制成平板。
2. 接种：用记号笔在平板底部划成两部分，在每部分分别写上菌名，用接种环取少量的待测菌，点接在培养基表面的相对应部分的中心，其中一个菌种应是枯草杆菌做对照菌
3. 培养：将接种后的平皿置于28℃恒温箱培养24h。
4. 检测：取出平板，打开平皿盖，滴加少量的碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板。菌落周围如出现无色透明圈，则说明淀粉已经被水解，表示该细菌具有分解淀粉的能力。可以用透明圈大小说明测试菌株水解淀粉能力的强弱。
二、油脂水解试验
1. 将装有油脂培养基的三角瓶置于沸水浴中熔化，取出并充分振荡，使油脂均匀分布，再倾入无菌平皿中，待凝固成平板。
2. 接种：于同一平皿的两边接种，其中一种是金黄色葡萄球菌作为对照菌。置于37℃恒温箱培养24h，取出后观察平板菌苔颜色，如果出现红色斑点，即说明脂肪被水解了，此反应为正反应。红色斑点大小说明测试菌株水解脂肪能力的强弱。
三、明胶液化试验
1. 接种：用穿刺接种法接种大肠杆菌或产气肠杆菌于明胶培养基中。
2. 培养：放20℃恒温箱中培养48h。若细菌在20℃下不长，则应放在*适温度下培养。
3. 观察结果：观察培养基有无液化情况及液化后的形状。因明胶在低于20℃时凝固，高于25℃时自行液化，若是在高于20℃下培养的细菌，观察时应放在冰浴中观察，若明胶被细菌液化，即使在低温下明胶也不会再凝固。
四、石蕊牛乳试验
1. 接种：将黏乳产碱杆菌和铜绿假单胞菌接种入石蕊牛乳培养基中。
2. 培养：将接种后的试管于37℃恒温培养7d，另外保留一支不接种的石蕊牛乳培养基作为对照。
3. 结果观察：取出培养物，以不接种任何细菌的试管为对照，观察接种不同细菌生长后的变化情况。
五、甲基红试验(M.R.试验)
将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，32℃培养?24h，加甲基红指示剂数滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。
注意事项
1. 在淀粉水解实验中，观察各种细菌的生长情况，加入碘液时要轻轻旋转，使得碘液均匀铺满整个平板。
2. 每个实验需要设置阴性和阳性对照组，以保证实验结果。
3. 细胞生长较快，需要及时观察和记录。
4. 接种前要用记号笔做好标记，接种时要对号接种。
其他
1.如何解释淀粉酶为胞外酶而非胞内酶：淀粉为大分子物质，进入细胞很困难，甚至需要高耗能的胞吞作用，因而通过胞外酶的作用，将淀粉水解为较小分子葡萄糖后再运入细胞内，不需要高耗能的胞吞作用。
2. 碘液的作用：由于淀粉经过水解会生成葡萄糖，葡萄糖为多羟基醛，因此可以利用醛这个基团的特征性质进行验证，比如银镜反应，斐林试剂等，呈阳性说明淀粉水解产生葡萄糖。阴性则说明淀粉没有被水解。
原创作者：上海岑特生物科技有限公司
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