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技术文章/ARTICLE

岑特技术：质粒提取实验步骤

点击次数：429 发布时间：2020/7/6 10:08:01

实验原理

现在较常用的质粒提取方法有三种:碱裂解法、煮沸法和去污剂裂解法，前两种方法较为剧烈，适用于较小的质粒（＜15Kb），而去污剂裂解法则比较温合，一般用于分子量较大的质粒（＞15Kb）。

碱裂解法是一种*广泛使用的制备质粒DNA的方法。其原理为：染色体DNA远大于质粒DNA，且染色体DNA为线状分子，而质粒为共价闭合环状分子。当pH值为 12.0-12.6，碱性环境中，线性的大分子的染色体DNA完全变性且无法复性，而共价闭环质粒DNA在将PH调至中性后即可恢复其天然构象；在高盐浓度存在的条件下，染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA仍在上清中。残留的杂质可以通过酚氯仿处理掉。

实验过程

1、实验试剂

（1）溶液Ⅰ 50mMl 葡萄糖 / 10mMl EDTA / 25mMl Tris-HCl,pH=8.0；

（2）溶液Ⅱ 0.2Ml NaOH / 1% SDS；

（3）溶液Ⅲ 3Ml 醋酸钾 / 2Ml 醋酸；

（4）异丙醇，无水乙醇，75%乙醇应放-20℃冰箱预冷备用；

酚氯仿放4℃冰箱预存；

（5）摇菌，2-3ml相应抗性的LB培养液，在37℃温度下过夜培养。

2、质粒提取

（1）菌液12000rcf离心5min，弃掉上清，加入0.2ml溶液I（已加入RNase），充分混匀后，加入0.25ml溶液II，颠倒混匀，室温放置5min，加入0.4ml 溶液III，颠倒混匀后，13000rcf 离心30min。

（2）上清转入新的1.5mlEP管中，加入等体积的酚氯仿混合液，充分混匀。10000rcf 离心10min。

（3）取上清，转入新的EP管，加入等体积、预冷的异丙醇，充分混匀后，13000rcf 离心 6min。

（4）倒掉上清液，用1ml预冷的75%乙醇，颠倒后，13000rcf 离心 1min。

（5）倒掉上清液，沿壁加入1ml预冷的75%乙醇，直接倒掉。

（6）沿壁加入1ml预冷的乙醇，直接倒掉。倒扣5min后，室温下放置10min。

待管内液体会发干净后，向管内加入100ul水，55℃孵育5min。

（7）所得质粒溶液可以放入-20℃中长期保存。

注意事项

若菌株为革兰氏阳性菌，该菌有一层细胞壁，必须加入溶菌酶才能使之溶解。
摇床速度不宜过高。达到OD600 1.5即可。
溶液I加入RNase后需要放在4℃中保存，以防酶失活。
溶液II和溶液III使用前需注意观察是否有沉淀，如有沉淀可37℃水浴处理。
溶液II处理菌体时间应控制在5分钟以内。

常见问题及解决方法

常见问题	原因	解决办法
质粒浓度低	溶液处理不充分	增加溶液I/II/III的加入量，或降低菌液体积。
	质粒拷贝数低	增加摇菌量，并降低*后的溶解体积
	菌体老化	重新质粒转化或划线后挑取单克隆摇菌
	乙醇残留	乙醇的存在会影响质粒的溶解和回收，须延长乙醇挥发时间
	洗脱液不合适	可配置合适的EB(10mM Tris-HCl, 1mMEDTA，pH8.5）
	洗脱体积较小	在保证质粒浓度的前提下，增加洗脱液的体积
质粒有杂带	菌液污染	重新质粒转化或划线后挑取单克隆摇菌
	试剂污染	质粒提取溶液重新配置，*后溶解液高压灭菌后使用