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技术文章/ARTICLE

定量western blot：为什么需要验证抗体

点击次数：772 发布时间：2019/8/20 10:10:05

验证抗体对于结果的一致性和重复性是至关重要的，即确认抗体能特异性识别感兴趣的蛋白，抗体与其他蛋白的交叉反应性情况。在您的论文提交给期刊发表之前，经常需要验证抗体的特异性，但并非所有人都花时间进行验证。或者很多人都认为他们使用抗体进行了免疫共沉淀验证，因而不需要再通过蛋白质印迹进行验证。然而，抗体与抗原的亲和性高度依赖于实验条件，因此，验证您的试验方法中的条件适用于抗体与抗原的结合是十分重要的。

定量western blot尤其适用于确认获得的信号仅来自感兴趣的蛋白。如果没有进行抗体验证（并且验证荧光信号与蛋白质的量呈线性关系），将无法获得下游定量分析所需的准确度和精确度。

为确保实验质量，抗体验证工作组提供了五种不同的抗体验证方法，其中四种方法适用于western blot，他们建议至少使用其中两种方法进行抗体验证。

遗传策略

尽管这些方法已经被更新了，但在科研领域中的生物化学家对他们应该都很熟悉。即用CRISPR-Cas9或RNA干扰（RNAi）在实验组和对照组中进行敲除或敲低实验，然后使用特异性抗体测定目标蛋白的荧光信号。处理后的目标蛋白质的表达很少甚至没有，所以观察到的任何信号都表明抗体存在交叉反应性。

如下图所示，将具有特定蛋白质的细胞裂解物进行western blot，分别使用两种不同siRNA分子敲低目的蛋白的表达，如泳道1和泳道2，与泳道C的对照组相比，我们可以看出siRNA脱靶带来的影响。

正交策略

这种方法的技术含量较低，它使用不依赖于抗体的方法（质谱法）来量化几个蛋白样品的靶信号，然后使用基于抗体的方法（western blot）同样量化相同蛋白样品的靶信号，*后将他们的信号值进行比较。例如，有几种靶向蛋白质组学方法可以量化不同样品中的蛋白质表达。当对抗体进行标记时应参考这些相关的定量数据。

下图比较了蛋白质印迹和质谱法测定蛋白表达量的相关性。通过对八种细胞系中蛋白表达量的测定，我们可以看到他们的相关性高达0.97，表明该抗体对于蛋白质印迹分析是有效的。