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人类基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析
点击次数：644 发布时间：2018/10/29 13:22:46
成功走出步：DNA提取
实验目的：
1.熟悉分子 生物学实验的操作特点。
2.掌握人类基因组DNA提取 的基本原理。
3.熟悉人类基因组 DNA提取的基本方法。
4.熟悉琼脂糖凝胶电泳的原理和操作。
实验原理：
用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，经苯酚﹑氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后，溶解于TE中即得到高分子量的DNA。
本次实验使用的试剂盒系直接加入裂解液裂解细胞后，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，并使用RNaseA降解RNA,再利用特殊硅基质膜吸附DNA的特性，可快速、高效地纯化回收基因组DNA。
操作步骤：
细胞裂解与RNase/蛋白酶K 消化
1. 取100 μl抗凝全血置于1.5ml Eppendorf离心管中，再加入100 μl裂解液和20 μl RNaseA/蛋白酶K液，用移液器来回吹打混匀，室于55℃温浴35分钟，其间来回颠倒离心管几次，直至溶液呈水溶状。
2. 加入10μl 3M的NaAc（pH 4.8），随后加入1250 μl结合缓冲液，充分振荡混匀，12，000 rpm离心30秒。
DNA与吸附柱结合
3.用移液器Tip转移上清并加入到离心吸附柱（套好收集管）中，放置1分钟，12，000 rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。
注意：待转移上清约1300μl，离心吸附柱容量约650 μl，故需每次转移上清650 μl到离心吸附柱中，离心，倒掉收集管中的废液，重复实验操作步骤3。
DNA的纯化
4. 再加入600 μl洗涤缓冲液（washing buffer）到离心吸附柱（套好收集管）中，12，000 rpm 离心30秒。
5.重复步骤4一次，12，000 rpm 离心3分钟以充分除去洗涤缓冲液。
6.小心取出离心吸附柱，弃收集管，将离心吸附柱套入一个干净的1.5ml Eppendorf 离心管，并加入50 μl洗脱缓冲液（elution buffer） 到离心吸附柱中（洗脱缓冲液一定要加在离心吸附柱的正中），放置1分钟，于12，000 rpm 离心30秒。
7.取出Eppendorf 离心管，其中便是所提取基因组DNA。
DNA的琼脂糖凝胶电泳
8.取8 -10μl基因组DNA,并加入2 μl上样缓冲液，混匀，加样到1%琼脂糖凝胶点样孔中，电泳。
实验目的：
1.熟悉分子 生物学实验的操作特点。
2.掌握人类基因组DNA提取 的基本原理。
3.熟悉人类基因组 DNA提取的基本方法。
4.熟悉琼脂糖凝胶电泳的原理和操作。
实验原理：
用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，经苯酚﹑氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后，溶解于TE中即得到高分子量的DNA。
本次实验使用的试剂盒系直接加入裂解液裂解细胞后，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，并使用RNaseA降解RNA,再利用特殊硅基质膜吸附DNA的特性，可快速、高效地纯化回收基因组DNA。
操作步骤：
细胞裂解与RNase/蛋白酶K 消化
1. 取100 μl抗凝全血置于1.5ml Eppendorf离心管中，再加入100 μl裂解液和20 μl RNaseA/蛋白酶K液，用移液器来回吹打混匀，室于55℃温浴35分钟，其间来回颠倒离心管几次，直至溶液呈水溶状。
2. 加入10μl 3M的NaAc（pH 4.8），随后加入1250 μl结合缓冲液，充分振荡混匀，12，000 rpm离心30秒。
DNA与吸附柱结合
3.用移液器Tip转移上清并加入到离心吸附柱（套好收集管）中，放置1分钟，12，000 rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。
注意：待转移上清约1300μl，离心吸附柱容量约650 μl，故需每次转移上清650 μl到离心吸附柱中，离心，倒掉收集管中的废液，重复实验操作步骤3。
DNA的纯化
4. 再加入600 μl洗涤缓冲液（washing buffer）到离心吸附柱（套好收集管）中，12，000 rpm 离心30秒。
5.重复步骤4一次，12，000 rpm 离心3分钟以充分除去洗涤缓冲液。
6.小心取出离心吸附柱，弃收集管，将离心吸附柱套入一个干净的1.5ml Eppendorf 离心管，并加入50 μl洗脱缓冲液（elution buffer） 到离心吸附柱中（洗脱缓冲液一定要加在离心吸附柱的正中），放置1分钟，于12，000 rpm 离心30秒。
7.取出Eppendorf 离心管，其中便是所提取基因组DNA。
DNA的琼脂糖凝胶电泳
8.取8 -10μl基因组DNA,并加入2 μl上样缓冲液，混匀，加样到1%琼脂糖凝胶点样孔中，电泳。
原创作者：上海岑特生物科技有限公司
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