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基于CRISPR的两种核酸检测新工具√岑特新闻
点击次数：684 发布时间：2018/9/10 9:42:05
CRISPR技术的两大豪门实验室分别开发出了一种工具。张锋实验室利用Cas13蛋白的天然RNase活性开发和优化了一种方法，包括SHERLOCK和SHERLOCK v2。Jennifer Doudna的实验室则利用Cas2a的非特异性ssDNA降解开发出另一种称为DETECTR的方法。
检测核酸的时候，大家都希望特异性和灵敏度越高越好。然而，目前的检测方法要么缺乏灵敏度，要么缺乏特异性，要么太贵太复杂，总之，缺点一大堆。好在，科学家近日利用Cas9蛋白的变体Cas13和Cas12a开发出简单又便宜的平台，能够可靠检测低水平的核酸。
CRISPR技术的两大豪门实验室分别开发出了一种工具。张锋实验室利用Cas13蛋白的天然RNase活性开发和优化了一种方法，包括SHERLOCK和SHERLOCK v2。Jennifer Doudna的实验室则利用Cas2a的非特异性ssDNA降解开发出另一种称为DETECTR的方法。
SHERLOCK和DETECTR分别利用Cas13和Cas12a对邻近ssRNA和ssDNA的切割和降解，来切割和激活报告基团。随后对这个报告基团产生的信号进行测定，即可确定感兴趣的DNA、RNA或突变是否存在。这两个系统都证实了CRISPR在诊断上的潜力。
SHERLOCK
Cas13（C2c2）是在2016年由张锋实验室发现的。在单个CRISPR RNA（crRNA）的引导下，它能够切割ssRNA或mRNA（类似于RNA干扰），实现基因敲低方面的应用。同时，Cas13还附带非特异性的ssRNA切割功能。SHERLOCK方法利用Cas13的混合RNase活性以及可淬灭的ssRNA报告基团，通过等温扩增步骤来快速检测单个DNA或RNA分子。
工作原理
在crRNA的引导下，Cas13识别并结合目标序列，这激发了它对周围ssRNA分子的“胡乱”切割。激活的Cas13切割可淬灭的荧光RNA，产生可定量的信号，表示目标核酸的存在。为了提高分析的灵敏度，样品的DNA或RNA首先经过RPA或RT-PRA扩增。RPA与T7转录相结合，将扩增后的DNA转化为RNA，便于后续的Cas13检测。这些步骤使得SHERLOCK的灵敏度达到attomolar，特异性达到单碱基错配。
实验室曾经证实SHERLOCK系统能够可靠检测亲缘关系相近的寨卡病毒和登革热病毒。它可检测血清、尿液和唾液中低浓度的寨卡病毒，并确定病毒载量，区分不同病毒株。它还可以对人类DNA进行基因分型，并鉴定游离DNA中的低频率癌症突变。
SHERLOCK v2
当然，SHERLOCK也存在一些限制。个限制是定量，因为系统依赖DNA的预扩增，这会导致报告基团饱和。SHERLOCK v2则在预扩增步骤中使用较少的引物，可以实现更好的定量而不影响灵敏度。研究人员还综合考虑多种Cas酶的切割偏好来创建一个多重平台。比如，在同一个反应中使用Cas13和Cas12a以及不同的荧光报告基团，可以准确检测多个目标。
SHERLOCK的第二个限制是它对荧光的依赖，这需要额外的设备来获取数据。于是，研究人员又对SHERLOCK v2进行了改进，让切割后的报告基团可通过试纸条来检测，就像验孕棒一样。这样，通过试纸条上的条带数量，就能确定目标DNA或RNA是否存在于特定样品中。试纸条方便运输，操作简单，不到一小时就能出结果，因此核酸检测可随时随地开展。
SHERLOCK v2这种核酸检测方法具有高灵敏度和高特异性，且不影响速度、易用性和便携性。因此，未来具有广阔的应用前景，包括临床诊断（比如病原体或病毒检测）、治疗和基因分型。SHERLOCK v2的优点在于实验室和现场都能轻松高效地开展。
DETECTR
Cas12a（Cpf1）是CRISPR Cas的一种变体，与Cas9一样能够切割dsDNA。不过，Cas12a识别不同的PAM位点，催化其自身的向导RNA成熟，并在dsDNA断裂后产生5’和3’交错的末端，特别适合基因编辑。
Jennifer Doudna的实验室在研究中发现，通过crRNA靶向感兴趣的dsDNA目标后，Cas12a还能以非特异性的方式切割ssDNA。这种非特异性的反式切割表现出多次周转事件（每秒约1250次）。于是，Doudna实验室便利用Cas12a的DNase活性开发出高度灵敏的DNA检测平台DETECTR。
工作原理
DETECR的工作原理与SHERLOCK相似。Cas12a通过crRNA靶向特定的DNA序列，如人乳头瘤病毒（HPV）基因组。同时将ssDNA-荧光淬灭（FQ）报道基团加入反应中，它在ssDNA降解时产生信号。为了提高灵敏度，首先通过RPA的等温扩增来扩增DNA。当Cas12a-cRNA与目标dsDNA配对时，Cas12a的DNase活性启动。随后，周围的ssDNA被降解，包括ssDNA-FQ报道基团在内。荧光信号可指示您感兴趣的DNA是否存在。
作为概念证明，研究人员利用DETECTR方法来检测HPV。他们发现，DETECTR可以在一小时内准确地区分人类细胞中两种相似的HPV亚型，HPV 16和HPV 18，灵敏度达到attomolar。因此，DETECTR具有快速检测患者样品中特定目标的能力，且具有高选择性和灵敏度。
DETECTR能够高效检测混合样本中的核酸，适用于一系列分子和临床诊断应用。Mammoth Biosciences公司已经着手对DETECTR技术进行开发，它的目标是提供基于CRISPR的平台 ，并以此基础开发各种生物传感的检测。
检测核酸的时候，大家都希望特异性和灵敏度越高越好。然而，目前的检测方法要么缺乏灵敏度，要么缺乏特异性，要么太贵太复杂，总之，缺点一大堆。好在，科学家近日利用Cas9蛋白的变体Cas13和Cas12a开发出简单又便宜的平台，能够可靠检测低水平的核酸。
CRISPR技术的两大豪门实验室分别开发出了一种工具。张锋实验室利用Cas13蛋白的天然RNase活性开发和优化了一种方法，包括SHERLOCK和SHERLOCK v2。Jennifer Doudna的实验室则利用Cas2a的非特异性ssDNA降解开发出另一种称为DETECTR的方法。
SHERLOCK和DETECTR分别利用Cas13和Cas12a对邻近ssRNA和ssDNA的切割和降解，来切割和激活报告基团。随后对这个报告基团产生的信号进行测定，即可确定感兴趣的DNA、RNA或突变是否存在。这两个系统都证实了CRISPR在诊断上的潜力。
SHERLOCK
Cas13（C2c2）是在2016年由张锋实验室发现的。在单个CRISPR RNA（crRNA）的引导下，它能够切割ssRNA或mRNA（类似于RNA干扰），实现基因敲低方面的应用。同时，Cas13还附带非特异性的ssRNA切割功能。SHERLOCK方法利用Cas13的混合RNase活性以及可淬灭的ssRNA报告基团，通过等温扩增步骤来快速检测单个DNA或RNA分子。
工作原理
在crRNA的引导下，Cas13识别并结合目标序列，这激发了它对周围ssRNA分子的“胡乱”切割。激活的Cas13切割可淬灭的荧光RNA，产生可定量的信号，表示目标核酸的存在。为了提高分析的灵敏度，样品的DNA或RNA首先经过RPA或RT-PRA扩增。RPA与T7转录相结合，将扩增后的DNA转化为RNA，便于后续的Cas13检测。这些步骤使得SHERLOCK的灵敏度达到attomolar，特异性达到单碱基错配。
实验室曾经证实SHERLOCK系统能够可靠检测亲缘关系相近的寨卡病毒和登革热病毒。它可检测血清、尿液和唾液中低浓度的寨卡病毒，并确定病毒载量，区分不同病毒株。它还可以对人类DNA进行基因分型，并鉴定游离DNA中的低频率癌症突变。
SHERLOCK v2
当然，SHERLOCK也存在一些限制。个限制是定量，因为系统依赖DNA的预扩增，这会导致报告基团饱和。SHERLOCK v2则在预扩增步骤中使用较少的引物，可以实现更好的定量而不影响灵敏度。研究人员还综合考虑多种Cas酶的切割偏好来创建一个多重平台。比如，在同一个反应中使用Cas13和Cas12a以及不同的荧光报告基团，可以准确检测多个目标。
SHERLOCK的第二个限制是它对荧光的依赖，这需要额外的设备来获取数据。于是，研究人员又对SHERLOCK v2进行了改进，让切割后的报告基团可通过试纸条来检测，就像验孕棒一样。这样，通过试纸条上的条带数量，就能确定目标DNA或RNA是否存在于特定样品中。试纸条方便运输，操作简单，不到一小时就能出结果，因此核酸检测可随时随地开展。
SHERLOCK v2这种核酸检测方法具有高灵敏度和高特异性，且不影响速度、易用性和便携性。因此，未来具有广阔的应用前景，包括临床诊断（比如病原体或病毒检测）、治疗和基因分型。SHERLOCK v2的优点在于实验室和现场都能轻松高效地开展。
DETECTR
Cas12a（Cpf1）是CRISPR Cas的一种变体，与Cas9一样能够切割dsDNA。不过，Cas12a识别不同的PAM位点，催化其自身的向导RNA成熟，并在dsDNA断裂后产生5’和3’交错的末端，特别适合基因编辑。
Jennifer Doudna的实验室在研究中发现，通过crRNA靶向感兴趣的dsDNA目标后，Cas12a还能以非特异性的方式切割ssDNA。这种非特异性的反式切割表现出多次周转事件（每秒约1250次）。于是，Doudna实验室便利用Cas12a的DNase活性开发出高度灵敏的DNA检测平台DETECTR。
工作原理
DETECR的工作原理与SHERLOCK相似。Cas12a通过crRNA靶向特定的DNA序列，如人乳头瘤病毒（HPV）基因组。同时将ssDNA-荧光淬灭（FQ）报道基团加入反应中，它在ssDNA降解时产生信号。为了提高灵敏度，首先通过RPA的等温扩增来扩增DNA。当Cas12a-cRNA与目标dsDNA配对时，Cas12a的DNase活性启动。随后，周围的ssDNA被降解，包括ssDNA-FQ报道基团在内。荧光信号可指示您感兴趣的DNA是否存在。
作为概念证明，研究人员利用DETECTR方法来检测HPV。他们发现，DETECTR可以在一小时内准确地区分人类细胞中两种相似的HPV亚型，HPV 16和HPV 18，灵敏度达到attomolar。因此，DETECTR具有快速检测患者样品中特定目标的能力，且具有高选择性和灵敏度。
DETECTR能够高效检测混合样本中的核酸，适用于一系列分子和临床诊断应用。Mammoth Biosciences公司已经着手对DETECTR技术进行开发，它的目标是提供基于CRISPR的平台 ，并以此基础开发各种生物传感的检测。
原创作者：上海岑特生物科技有限公司
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