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PCR的试验污染原因和预防对策

点击次数：240 发布时间：2022/12/15 10:06:12

PCR的试验污染

PCR反应的/大特点是具有较大扩增能力与高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，其微量的污染即可造成假阳性的产生。

污染原因

1、标本间交叉污染：标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。

2、PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

3、PCR扩增产物污染：这是PCR反应中主要常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大（一般为1013拷贝/ml），远远高于PCR检测数个拷贝的限，所以微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。还有一种容易忽视，可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染。在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。

4、实验室中克隆质粒的污染：在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力。其污染可能性也很大。

污染的监测

一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

1、阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高（100个拷贝以下）。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

2、阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括：

（1）标本对照：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。

（2）试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。

3、重复性试验。

4、选择不同区域的引物进行PCR扩增。

原创作者：上海岑特生物科技有限公司